植物電圧依存型カルシウムチャネルA+TPC1の分子生物学的機能解析

申請者はゲノム情報を解析して、シロイヌナズナから動物のL-タイプ電位依存型Ca^<2+>チャネルα-サブユニットと2次構造において高い相同性を示す遺伝子(AtTPC1)を見出し、酵母発現系や発光カルシウムインジケーター蛋白質であるエクオリンを導入した形質転換植物を用いた解析から、AtTPC1が植物で初めて単離された電位依存型Ca^<2+>チャネル遺伝子であることを間接的に証明した(Furuichi et al., 2001a)。本年度の研究では、AtTPC1が電位依存型Ca^<2+>チャネルであることを直接的に証明する為、パッチクランプ法を用いた解析を行った。AtTPC1過剰発現タバコBY-2培養細胞およびNtTPC1発現抑制株を用いたパッチクランプ法による電気生理学的解析から、AtTPC1およびNtTPC1は形質膜の過分極によって活性化される電圧依存型Ca^<2+>チャネルであることを証明した。また、イギリスのグループから同蛋白質が液胞膜にも局在し、SVチャネルとして機能することを示唆する論文が発表されたのでAtTPC1の細胞内局在部位について更に詳細な解析を行った。その結果、AtTPC1蛋白質の大部分は液胞膜に局在するものの、一部は形質膜に局在すること、液胞型AtTPC1では結合蛋白質の作用により形質膜型と異なるCa^<2+>依存性を示すことを明らかとした。併行して行った結合蛋白質同定実験では、上述の機能制御ユニットの同定は行えていないものの、AtTPC1を液胞へ移行させる輸送蛋白質の同定に成功した。(論文作成中)AtTPC1によって情報伝達が行われると類推される糖、窒素化合物をシグナル分子とした情報伝達系や、カルシウムシグナリング以降に活性化される蛋白質リン酸化酵素カスケードについて、3報の論文を発表した。

申請者はゲノム情報を解析して、シロイヌナズナから動物のL-タイプ電位依存型Ca^<2+>チャネルα-サブユニットと2次構造において高い相同性を示す遺伝子(AtTPC1)を見出し、酵母発現系や発光カルシウムインジケーター蛋白質であるエクオリンを導入した形質転換植物を用いた解析から、AtTPC1が植物で初めて単離された電位依存型Ca^<2+>チャネル遺伝子であることを間接的に証明した(Furuichi et al., 2001a)。本年度の研究では、AtTPC1が電位依存型Ca^<2+>チャネルであることを直接的に証明する為、パッチクランプ法を用いた解析を行った。AtTPC1過剰発現タバコBY-2培養細胞およびNtTPC1発現抑制株を用いたパッチクランプ法による電気生理学的解析から、AtTPC1およびNtTPC1は形質膜の過分極によって活性化される電圧依存型Ca^<2+>チャネルであることを証明した。また、イギリスのグループから同蛋白質が液胞膜にも局在し、SVチャネルとして機能することを示唆する論文が発表されたのでAtTPC1の細胞内局在部位について更に詳細な解析を行った。その結果、AtTPC1蛋白質の大部分は液胞膜に局在するものの、一部は形質膜に局在すること、液胞型AtTPC1では結合蛋白質の作用により形質膜型と異なるCa^<2+>依存性を示すことを明らかとした。併行して行った結合蛋白質同定実験では、上述の機能制御ユニットの同定は行えていないものの、AtTPC1を液胞へ移行させる輸送蛋白質の同定に成功した。(論文作成中)AtTPC1によって情報伝達が行われると類推される糖、窒素化合物をシグナル分子とした情報伝達系や、カルシウムシグナリング以降に活性化される蛋白質リン酸化酵素カスケードについて、3報の論文を発表した。