遺伝子座特異的にヒストン修飾の変化を検出するライブセルイメージング手法の開発

开发活细胞成像方法来检测组蛋白修饰的位点特异性变化

• 批准号: 26891019
• 负责人: 岡田 悟
• 金额: $ 0.92万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-08-29 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26891019/
• 关键词: ライブセルイメージング; エピジェネティクス

ヒストンの翻訳後修飾の動的側面を理解するためには、「どのタイミングで」「どの細胞において」「どの種類の修飾が」「ゲノム上のどの位置で」生じるのかを調べることが必要不可欠である。本研究では特に、生細胞においてゲノム上の位置情報を可視化するための手法として、CRISPR/Cas9システムを利用することを試みた。材料として、遺伝学的な操作が容易なモデル真核生物である出芽酵母を用いた。遺伝子座を特定するツールとして、化膿レンサ球菌の持つ防御機構に関連したエンドヌクレアーゼであるCas9の変異体dCas9（エンドヌクレアーゼ活性を持たない）にGFPと核移行シグナルを連結したタンパク質dCas9-GFPを用いた。可視化の効率を評価するにあたっては、モデル標的としてCUP1遺伝子（コピー数は菌株によって1-20の範囲）を用いた。出芽酵母においてdCas9-GFPとともにCUP1遺伝子に対するガイドRNA（gRNA）を発現させ、蛍光顕微鏡で観測した場合、CUP1遺伝子を10コピー程度もつ菌株において、核内かつ核小体外の位置にdCas9-GFPの輝点が観察された。標的配列部分を持たないgRNAを発現させた細胞およびgRNAを発現させていない細胞においてはdCas9-GFPの輝点は観察されなかった。CUP1遺伝子に対するgRNAを複数設計しそれぞれをdCas9-GFPとともに発現させたところ、gRNAの配列に依存して、dCas9-GFPの輝点が観察される頻度に差異があった。以上の結果は、dCas9-GFPとgRNAの組み合わせによって特定の遺伝子座を可視化できる可能性を示すものである。現在、より少ないコピー数の遺伝子を検出しうる手法を開発するとともに、外的刺激の有無（CUP1遺伝子は銅の添加で発現上昇を示すことが既知）によるdCas9-GFP輝点の挙動の変化を観測することを試みている。

The bottom surface of the modified structure after the transformation is understood,"the top surface of the cell","the bottom surface of the modified structure of the cell","the top surface of the cell","and the bottom surface of the modified structure of the cell" are necessary. In this study, we tried to visualize the position information of CRISPR/Cas9 cells. Materials and genetic engineering are easy to manipulate. Eukaryotes are easy to use. The gene locus is specific to the host defense mechanism of pyogenic bacteria. The gene locus is related to the host defense mechanism of pyogenic bacteria. The gene locus is related to the host defense mechanism of pyogenic bacteria. The gene locus is related to the host defense mechanism of pyogenic bacteria. Visual evaluation of the rate of infection: CUP1 gene (number of strains: 1-20) In budding yeasts, dCas9-GFP was detected at the position of CUP1 gene, and dCas9-GFP was detected at the position of CUP1 gene outside the nucleosomes. The target sequence contains the gRNA and the gRNA. CUP1 gene expression is associated with multiple gRNAs, and the frequency of detection of dCas9-GFP is different. These results indicate the possibility of visualizing specific loci for dCas9-GFP gRNA assembly. Now, there are a few ways to detect the presence or absence of external stimuli (CUP1 gene is added to the copper and appears to rise).