Measurement of histone modification propagation velocity in a single living cell using CRISPR and BiFC

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ヒストンの翻訳後修飾は、DNAのメチル化と並んで、エピジェネティック制御における中核的な分子機構である。その動態を理解するためには、「どのタイミングで」「どの細胞において」「どの種類の修飾が」「細胞核内のどの領域において」「ゲノム上のどの位置で」生じるのかを調べる必要がある。本研究では、CRISPR/Cas9システム、ヒストン修飾認識ドメイン、Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)を組み合わせて利用する。本研究では、これらの組み合わせにより、上記の情報要素すべてを同時に取り出すことのできるイメージング手法を確立し、これを用いてヒストン修飾がゲノム上を伝搬していく速度を単一の生細胞単位で計測する。このような計測を通じて、細胞ごとにヒストン修飾伝搬速度はどの程度バラつきうるのか?修飾酵素のリクルート因子やヒストンリモデラーの変異はヒストン修飾伝搬速度に対して単一細胞単位でどのような影響を及ぼすのか?クロマチンの核内位置とヒストン修飾伝搬速度の関係は?といった、これまで検証されてこなかった疑問に対して答えを得ることを目的とする。今年度は、CRIPSR/Cas系を用いてゲノム上の特定位置にDNA二本鎖切断を生じさせるためのガイドRNAを効率よく選抜することを企図して、細胞内でのガイドRNAの機能性を評価するための簡便なイメージング手法の開発を試みた。一本鎖DNA結合タンパク質であるRPAを蛍光タンパク質タグで可視化し、その輝度を観測することで、Cas-gRNA複合体によるDNA DSB形成効率を評価する系を構築し、蛍光輝度とゲノム編集効率の間に高い相関が見られることを確認した。