細胞外基質による血管前駆細胞の分化誘導-血管内膜増殖阻害の試み-

1)血中血管前駆細胞の分離・培養 ヒト静脈血より血管前駆細胞を培養する方法を確立した。静脈血より単球をHistropaque-1077で分離後、growth factorを添加したEGM-2 mediumにてfibronectin-coated dishで培養。7日目に細胞をトリプシン処理しDiI acLDL、UEA-1での染色、VEGFR2、CD31、CD34にてフローサイトメトリー(FCM)を行った。ほとんどの細胞でDiI acLDL、UEA-1がdual positiveであり、またFCMでVEGFR2、CD31の発現増強がみられた。以上より、末梢血中の単球が血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cell ; EPC)へ分化誘導されていることが確認できた。2)血管内皮前駆細胞の細胞外基質への接着の検討 上記のように分化誘導した7日目の血管内皮前駆細胞を用いて、様々な細胞外マトリックスに対する接着について検討した。ラミニン1、ラミニン8、ラミニン10、I型コラーゲン、IV型コラーゲンを96-wellにコートして、1時間のadhesion assayを行った。結果、ラミニン10に対しての接着が最もよく、ついでラミニン8>ラミニン1>IV型コラーゲン>I型コラーゲンの順であった。3)血管内皮前駆細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ分泌能の検討 様々な細胞外マトリックスの上で、EPCのマトリックスメタロプロテアーゼ-2(MMP-2)分泌能に違いがあるかについて検討した。ラミニン1、ラミニン8、ラミニン10、I型コラーゲン、IV型コラーゲンを96-wellにコートして7日目のEPCを再プレート。FBS(-)のmediumにて48時間培養後、medium中のMMP-2濃度をELISAで測定した。EPCはMMP-2をすべての細胞外マトリックス上で分泌しており、特にラミニン8、I型コラーゲンで多くのMMP-2分泌が認められた。

1)血中血管前駆細胞の分離・培養 ヒト静脈血より血管前駆細胞を培養する方法を確立した。静脈血より単球をHistropaque-1077で分離後、growth factorを添加したEGM-2 mediumにてfibronectin-coated dishで培養。7日目に細胞をトリプシン処理しDiI acLDL、UEA-1での染色、VEGFR2、CD31、CD34にてフローサイトメトリー(FCM)を行った。ほとんどの細胞でDiI acLDL、UEA-1がdual positiveであり、またFCMでVEGFR2、CD31の発現増強がみられた。以上より、末梢血中の単球が血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cell ; EPC)へ分化誘導されていることが確認できた。2)血管内皮前駆細胞の細胞外基質への接着の検討 上記のように分化誘導した7日目の血管内皮前駆細胞を用いて、様々な細胞外マトリックスに対する接着について検討した。ラミニン1、ラミニン8、ラミニン10、I型コラーゲン、IV型コラーゲンを96-wellにコートして、1時間のadhesion assayを行った。結果、ラミニン10に対しての接着が最もよく、ついでラミニン8>ラミニン1>IV型コラーゲン>I型コラーゲンの順であった。3)血管内皮前駆細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ分泌能の検討 様々な細胞外マトリックスの上で、EPCのマトリックスメタロプロテアーゼ-2(MMP-2)分泌能に違いがあるかについて検討した。ラミニン1、ラミニン8、ラミニン10、I型コラーゲン、IV型コラーゲンを96-wellにコートして7日目のEPCを再プレート。FBS(-)のmediumにて48時間培養後、medium中のMMP-2濃度をELISAで測定した。EPCはMMP-2をすべての細胞外マトリックス上で分泌しており、特にラミニン8、I型コラーゲンで多くのMMP-2分泌が認められた。