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Integrative Structural Biology Studies on the development for safe and efficient Cas3 genome editing tools

安全高效Cas3基因组编辑工具开发的综合结构生物学研究

基本信息

批准号：
22H02266
负责人：
竹下浩平
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

近年、クラス1タイプIに属するCRISPR-Cas3システムを用いた真核細胞における国産ゲノム編集ツールの開発が進んでいる。クラス2タイプIIのCas9は二本鎖DNAを切断して小さな欠失変異を導入するが、Cas3は、標的DNAと相補的なcrRNAを結合したCascadeが標的DNA領域に結合したサイトに結合し、数百~数キロに渡る大規模欠失変異を導入する。一方で二次的なDNA切断によって予期せぬ欠失変異が懸念される。この二次的なDNA切断活性の発現メカニズムを理解できれば、より安全なゲノム編集ツールとして開発が可能であるが、そのメカニズムは未だ不明である。そのためには、ターゲットDNAのnon-target鎖を特異的に切断するメカニズムと、target鎖を切断する活性や非特異的にCas3近傍の一本鎖DNAを切断する二次的な活性のメカニズムの違いを詳細に理解する必要がある。そしてそれらのメカニズムの使い分けを可能としている構造的特徴を捉え二次的なDNA切断活性を欠損させた新規かつ安全な大腸菌由来Cas3改変体を開発する。本研究では我々が開発した大腸菌由来Cas3の効率的生産システムにより得られた高品質なタンパク質を用い、未だ明らかとなっていない大腸菌由来Cas3の原子分解能での構造解析を行い、機能と密接に関係した構造的特徴を捉える。本研究によって開発された新しいCRISPR-Cas3システムは安全性が担保されると考えられ、新規モデル動物の開発、遺伝子治療研究等に寄与するだけでなく、Cas9関連の知財に係らない国産ゲノム編集ツールの開発を推進するものである。

In recent years, クラス 1 タイプ I に genus する CRISPR - Cas3 システムを with いた eukaryotic cells における domestic ゲノ compiling ツムールの open 発が into んでいる. クラス 2 タイプ II の Cas9 は 2 lock を cut DNA して small さな owe - vision loss を import するが, Cas3 は, target DNA と phase of な crRNA を combining した Cascade にが target DNA field combining したサイトに combining し, hundreds of ~ キロに crossing る large-scale owe lost - different を import する. The なDNA cleavage of one party で twice によって is expected to せぬ cause abnormal が suspense される. この secondary な DNA cut active の発 now メカニズムを understand できれば, より security なゲノ compiling ツムールとして open 発が may であるが, そのメカニズムは not unknown だである. そのためには, ターゲット DNA の non - target lock を specific に cut するメカニズムと, target lock を cut する active や nonspecific に Cas3 nearly alongside のを cut off a lock DNA する secondary な activity のメカニズムの violations いをに detailed understanding する necessary がある. そしてそれらのメカニズムの make い points けを may としている structure of 徴を catch え secondary な DNA cut active を owe loss させた new rules かつ security な coliform origin Cas3 change - body を open 発する. This study では I 々が open 発した coliform origin Cas3 の sharper rate production システムにより have られた high-quality なタンパク qualitative をい, not だ Ming らかとなっていない coliform origin Cas3 の atomic decomposition can での tectonic line analytical をい, functional と contact に masato is した structure of 徴を catch える. This study によって open 発された new しい CRISPR - Cas3 システムはが safety guarantee されると exam えられ, new rules モデル animal の発, heritage 伝 son treatment research に send するだけでなく, Cas9 masato even の know money にらない domestic ゲノ compiling ツムールの open 発を propulsion するものである.