权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

狙ったDNAが過剰メチル化された疾患モデル動物作製法の開発

开发一种创建目标 DNA 高甲基化疾病模型动物的方法

基本信息

批准号：
22H02537
负责人：
堀居拓郎
金额：
$ 8.74万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02537/
关键词：
エピゲノム編集メチル化 DNAメチル化 dCas9 プラダー・ウィリー症候群

项目摘要

DNAメチル化をはじめとするエピジェネティック修飾は、遺伝子発現や染色体構造を制御し、その破綻は様々な疾病を引き起こすと考えられる。これまでに我々は高効率エピゲノム編集法を開発し（Nat Biotechnol 2016）、標的領域のDNA脱メチル化により、インプリンティング疾患であるシルバー・ラッセル症候群のエピゲノム編集モデルマウスの作製に成功した（Genome Biol 2020）。一方、DNAの過剰メチル化による疾患モデル動物の報告はまだない。その原因として、導入したDNAの過剰メチル化状態を個体で維持することが難しい点が挙げられる。令和4年度は、DNAメチル基転移酵素であるDnmt3aやDnmt3bに加え、補因子であるDnmt3lやKRABなどをマウス初期胚で共発現することにより、安定したメチル化編集法を確立することを試みた。Dnmt3aまたはDnmt3b単独による過剰メチル化導入では、数日でメチル化状態が元に戻ってしまうことから、補因子であるDnmt3lやKRABの共発現によりエピゲノム編集状態が長期間維持されるのか検討した。過剰メチル化の標的として、PWSの原因領域と考えられているSnrpn-DMRを選択した。マウスES細胞に、エピゲノム編集の最小単位であるdCas9-SunTagとscFv-Dnmt3b、Snrpn-DMRに対するgRNA（６種類）の発現ベクターに加え、Dnmt3lおよびKRAB強制発現ベクターをトランスフェクションし共発現させた。１ヶ月間継代培養したところ、Dnmt3bとKRABを組み合わせた場合に、最も安定的にDNAメチル化が維持された。Dnmt3b単独またはKRAB単独では十分なメチル化導入と維持を行うことができなかった。一方、Dnmt3lはDNAメチル化の長期維持に必ずしも必要な因子ではなかった。

DNA modification, gene development, chromosome structure control, and disease initiation The development of a highly efficient DNA editing method (Nat Biotechnol 2016) and the successful development of a DNA defragmentation and DNA editing method for target domains (Genome Biol 2020). A report of a disease in an animal that has been infected with DNA has been published. The reason for this is that the introduction of DNA into an individual's body is difficult to maintain. Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt 3l, Dnmt3l, Dnmt 3 Dnmt3a and Dnmt3b are independent of each other, and the compilation status of Dnmt3l and KRAB is maintained for a long time. The cause of PWS is the subject of a series of investigations into SNRP-DMR. The minimum unit of ES cell, Dnmt3b, Snrpn-DMR, and Dnmt3l were selected for the expression of gRNA (6 species). During the first three months of culture, Dnmt3b and KRAB were combined to maintain the most stable DNA integration. Dnmt3b single Dnmt3l is a necessary factor for long-term maintenance of DNA.