慢性腎臓病に起因する健康寿命減衰をリン（CPP）の除去により防ぎ止める橋渡し研究

本研究ではKlotho遺伝子ノックアウトブタを作出し、表現型解析とCPP吸着カラムでの治療を行うことを目的とする。Klotho遺伝子をノックアウトすると胎生期に流産を起こすという報告があるため、2022年度ではCRISPR/Cas9によるゲノム編集でKlothoノックアウトブタの作出と並行し、腎臓特異的Klotho遺伝子コンディショナルノックアウトブタを作出するための条件検討を行った。①ブタ胚でKlotho遺伝子を高効率にノックアウトするためのgRNAの設計と効率評価Klotho遺伝子を標的とするgRNAを5種類作製し、エレクトロポレーションにより体外受精卵にCas9タンパク質とともに導入した。7日間の体外発生培養後、胚の発生能とゲノム編集効率を評価した。エレクトロポレーションを行っていない対照区(Control)と比較し、胚発生能（分割率、胚盤胞形成率）に対する有意な影響は確認できなかった。作製した胚盤胞について、シークエンシングによる遺伝子解析を行い、遺伝子変異を指標にゲノム編集の効率を評価し、受精卵において効率よく両アレル欠損を起こす2種のgRNAを選定した。加えて、それら2種のgRNAを用いてKlotho遺伝子を改変した胚を作成し、受胚豚への移植を実施した（経過観察中）。②ブタ胚でのAAVベクターによるノックイン条件の検討腎臓特異的Klotho遺伝子コンディショナルノックアウトを達成するためには、Klotho遺伝子の標的エクソン領域をloxP配列で挟んだノックインブタを作出する必要がある。しかし、ブタの受精卵ではAAVベクターを用いた外来遺伝子のノックインについてほとんど検討がなされていない。本年度はAAVベクターがブタ受精卵に感染すること、暴露濃度の調整により胚発生能に影響しないことを確認した。

本研究ではKlotho遺伝子ノックアウトブタを作出し、表現型解析とCPP吸着カラムでの治療を行うことを目的とする。Klotho遺伝子をノックアウトすると胎生期に流産を起こすという報告があるため、2022年度ではCRISPR/Cas9によるゲノム編集でKlothoノックアウトブタの作出と並行し、腎臓特異的Klotho遺伝子コンディショナルノックアウトブタを作出するための条件検討を行った。①ブタ胚でKlotho遺伝子を高効率にノックアウトするためのgRNAの設計と効率評価Klotho遺伝子を標的とするgRNAを5種類作製し、エレクトロポレーションにより体外受精卵にCas9タンパク質とともに導入した。7日間の体外発生培養後、胚の発生能とゲノム編集効率を評価した。エレクトロポレーションを行っていない対照区(Control)と比較し、胚発生能（分割率、胚盤胞形成率）に対する有意な影響は確認できなかった。作製した胚盤胞について、シークエンシングによる遺伝子解析を行い、遺伝子変異を指標にゲノム編集の効率を評価し、受精卵において効率よく両アレル欠損を起こす2種のgRNAを選定した。加えて、それら2種のgRNAを用いてKlotho遺伝子を改変した胚を作成し、受胚豚への移植を実施した（経過観察中）。②ブタ胚でのAAVベクターによるノックイン条件の検討腎臓特異的Klotho遺伝子コンディショナルノックアウトを達成するためには、Klotho遺伝子の標的エクソン領域をloxP配列で挟んだノックインブタを作出する必要がある。しかし、ブタの受精卵ではAAVベクターを用いた外来遺伝子のノックインについてほとんど検討がなされていない。本年度はAAVベクターがブタ受精卵に感染すること、暴露濃度の調整により胚発生能に影響しないことを確認した。