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慢性腎臓病に起因する健康寿命減衰をリン（CPP）の除去により防ぎ止める橋渡し研究

通过除磷（CPP）预防慢性肾病引起的健康预期寿命下降的转化研究

基本信息

批准号：
22H02541
负责人：
谷原史倫
金额：
$ 10.9万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02541/
关键词：
ゲノム編集ブタ腎不全 Klotho CPP

项目摘要

本研究ではKlotho遺伝子ノックアウトブタを作出し、表現型解析とCPP吸着カラムでの治療を行うことを目的とする。Klotho遺伝子をノックアウトすると胎生期に流産を起こすという報告があるため、2022年度ではCRISPR/Cas9によるゲノム編集でKlothoノックアウトブタの作出と並行し、腎臓特異的Klotho遺伝子コンディショナルノックアウトブタを作出するための条件検討を行った。①ブタ胚でKlotho遺伝子を高効率にノックアウトするためのgRNAの設計と効率評価Klotho遺伝子を標的とするgRNAを5種類作製し、エレクトロポレーションにより体外受精卵にCas9タンパク質とともに導入した。7日間の体外発生培養後、胚の発生能とゲノム編集効率を評価した。エレクトロポレーションを行っていない対照区(Control)と比較し、胚発生能（分割率、胚盤胞形成率）に対する有意な影響は確認できなかった。作製した胚盤胞について、シークエンシングによる遺伝子解析を行い、遺伝子変異を指標にゲノム編集の効率を評価し、受精卵において効率よく両アレル欠損を起こす2種のgRNAを選定した。加えて、それら2種のgRNAを用いてKlotho遺伝子を改変した胚を作成し、受胚豚への移植を実施した（経過観察中）。②ブタ胚でのAAVベクターによるノックイン条件の検討腎臓特異的Klotho遺伝子コンディショナルノックアウトを達成するためには、Klotho遺伝子の標的エクソン領域をloxP配列で挟んだノックインブタを作出する必要がある。しかし、ブタの受精卵ではAAVベクターを用いた外来遺伝子のノックインについてほとんど検討がなされていない。本年度はAAVベクターがブタ受精卵に感染すること、暴露濃度の調整により胚発生能に影響しないことを確認した。

本研究通过对克罗索·洛索子教授所做的关于反腐败的实验，表型解析了CPP在奇维塔韦基亚治理下进行的反腐败目的。Klotho基因组测序结果显示，2022年度CRISPR/Cas9基因组测序集Klotho基因组测序结果显示，Kl①克隆人Klotho基因组高表达率的克隆人gRNA的高表达率的克隆人Klotho基因组中的gRNA片段5的制备方法，克隆人Klotho基因组中的高表达量的申请体外筛选Cas9基因组。7日間の体外発生培養後、胚の発生能とゲノム編集効率を評価した。免疫组化检测显示，正常对照区（Control）的免疫比浊、免疫生能（分化率、分化细胞形成率）的表达有意识地受到影响。作人工耳蜗植入的细胞凋亡模型，人工耳蜗植入的细胞凋亡模型，细胞凋亡基因的解析行标，细胞凋亡基因的指征，细胞凋亡的集合率测定，精受激细胞凋亡模型率的节点，细胞凋亡引起的2种gRNA诱导率测定。添加外源基因，诱导2种gRNA用外源基因Klotho洛索子修饰后，经诱导合成，受外源基因转移阻碍而形成突变（绍氏示波中）。②克隆化AAV病毒载体的克隆化条件下，克隆化病毒特异性的Klotho病毒载体的克隆化过程中，克隆化病毒载体的克隆化区域loxP配列后，克隆化病毒载体的克隆化过程中，产生了必需的克隆。但是，由于病毒感染的原因，AAV病毒感染者使用外源基因来复制病毒，因此病毒感染者的数量也会增加。本年度将AAV疫苗接种人群中受感染的儿童接种，暴露程度适当调整申请人能否接种疫苗。