Development of integrative methods for correlative studies among dynamics, nano-localization, and function using simultaneous multi-color single-molecule and super-resolution imaging

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「分子を観て、機能を知る」ために、申請者らが開発した超解像１分子多種同時イメージング法を統合的に用い、動態・ナノ局在・機能“場”同時、かつ、多種分子同時の分子イメージング、多種類データ取得、多様な時空間定量データ群を統合的に相関解析し、分子機能を解明する『動態・ナノ局在・機能相関学』を創出することを目的として、次を行った。１．超解像１分子多種同時イメージング顕微鏡の改良。『動態・ナノ局在・機能相関学』創出に必要な性能を満たすべく、高精度高速超解像イメージングと１分子蛍光イメージングを生細胞で同時観察できる４色までの多色対応蛍光顕微鏡として、現有設備を改良した。２．蛍光標識分子の調製。超解像用にはphoto- switchable fluorescent proteins、１分子イメージング用にはGFP/SNAP-tag蛍光色素などを、目的タンパク質遺伝子(RNAポリメラーゼII、転写制御分子等)に導入した。３．１分子イメージング動態解析。申請者らの開発した移動部分軌跡解析法を用い、１分子イメージング軌跡追跡により、分子動態を時間・空間の関数として定量計測した(Sci Rep, 2017)。部分軌跡を全軌跡中で１点ずつずらしてゆくことで経時変化を追い、動態・分子間相互作用情報を時間・空間の関数として定量した。４．超解像解析。局在化方式(PALM/STORM) 超解像画像を、20～30 nm程度以上の高精度にてナノ局在解析した。５．領域マーカー対応。超解像と１分子軌跡の重ね合わせ画像（2～3色）に、1～2色の領域マーカー画像を重ね合わせ、分子局在・分子動態・相互作用を、注目領域と関連付けながら、時間・空間の関数として定量した。６．cluster解析を行い、以上で得られたデータ郡を、相互に関連付けながら、一連の解析フローとして相関解析するプログラムシステムを構築した。