分子間相互作用の可視化と細胞内分子定量イメージング

分子相互作用的可视化和细胞内分子的定量成像

• 批准号: 11242206
• 负责人: 徳永 万喜洋
• 金额: $ 115.2万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11242206/
• 关键词: 1分子イメージング; 1分子ナノテクノロジー; 薄層斜光照明法; 蛍光顕微鏡; 細胞質核間分子輸送; 定量的画像解析; 分子機構定量解析; 対物レンズ型全反射照明法; 低角斜光照明法; 細胞質核間輸送; 対物レンズ型全反射照明; 共焦点顕微鏡; 核輸送

細胞内部の蛍光1分子イメージングを、薄層斜光照明法を用いて行い、細胞内部での分子数と分子間相互作用を定量的に解析した。細胞質・核間輸送を担うImportin beta分子と核膜孔複合体との相互作用に関し、1分子と核膜孔1個との蛍光強度比から、結合分子数を定量した。濃度を変え、核膜孔との結合分子数・結合定数を求めた。その結果、2種類の結合部位があることが見つかり、弱い結合部位は、最大結合分子数110(+60,-40)個、解離定数70(+50,-30)nM、強い結合部位は、最大結合分子数7(+6,-4)個、解離定数0.3(+0.2,-0.1)nMであった。核膜孔複合体の構造には8回対称性があるので、強い結合部位の個数は、8個(もしくは16個)と推定される。1分子像の経時変化から、Importin betaと核膜孔複合体の結合時間(滞在時間)を求め、弱い結合が約1秒、強い結合が6秒以上、輸送中が約3秒であった。核内移行の輸送活性を蛍光像から直接計測したところ、細胞レベルの核内輸送速度と、以上の1分子計測で求めた値とがよく一致し、1分子解析による新しい手法が有用であることを示した。強い結合部位は核膜孔通過と密接な関係にあり、弱い結合部位はたくさんの分子を結合させて輸送される分子を集める役割を果たしていると考えられる。相互作用の強弱および変化により選択的な通過を実現しており、たくさんの分子を集めることにより通過速度を速めているという、新しいモデルを提案した。

The analysis of molecular interactions inside cells using oblique light and thin layer illumination Cytoplasmic/nuclear transport is responsible for the interaction between Importin beta molecules and nuclear pore complexes. The number of molecules bound to each other is quantified. Concentration, pore size, binding molecule number, binding constant number Results: 2 kinds of binding sites The structure of the nuclear pore complex is 8 symmetric, and the number of strong binding sites is 8 (or 16). 1 Molecular image time-varying, Importin beta, binding time (lag time) of nuclear pore complex, weak binding for about 1 second, strong binding for more than 6 seconds, transport for about 3 seconds. Direct measurement of nuclear transport activity by optical imaging, measurement of nuclear transport velocity by cellular imaging, measurement of molecular transport activity by molecular imaging, measurement by molecular analysis, measurement The strong binding sites are closely related to the nuclear membrane, and the weak binding sites are closely related to the molecular transport. The strength of the interaction is too high to change. The molecules pass through. The speed of the interaction is too high to change.

项目成果

徳永万喜洋: "生きた細胞内でうごめく「分子の振舞い」をダイナミックな映像で可視化"ダイヤモンド・ループ ダイヤモンド社. 4. 38 (2004)

Makihiro Tokunaga：“用动态图像可视化活细胞内移动的‘分子行为’” Diamond Loop Diamond Inc. 4. 38 (2004)

Yamaichi, Y.: "migS, a cis-acting site that affects bipolar positioning of oriC on the Escherichia coli chromosome"EMBO J.. 23(1). 221-233 (2004)

Yamaichi, Y.：“migS，一种影响大肠杆菌染色体上 oriC 双极定位的顺式作用位点”EMBO J.. 23(1)。

Hirabayashi, Y: "The Wnt-beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells"Development. (in press). (2004)

Hirabayashi, Y：“Wnt-β-连环蛋白途径指导皮质神经前体细胞的神经元分化”的发展。

増山典久: "実験医学 増刊"羊土社. 258-264 (2003)

增山纪久：《实验医学特别版》Yodosha 258-264 (2003)

安永 卓生: "これからの大学等研究施設 生命科学編"電子顕微鏡とその施設. 8-3-8-6 (2002)

Takuo Yasunaga：“未来大学研究设施 - 生命科学版”电子显微镜及其设施（2002 年）。