糖転移酵素群によるNOTCHタンパク質の分泌・分解の仕分け機構の解明

阐明糖基转移酶分泌和降解 NOTCH 蛋白的分选机制

基本信息

批准号：
22H02815
负责人：
岡島徹也
金额：
$ 11.23万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02815/
关键词：
NOTCH O-GlcNAc EOGT POFUT1 POGLUT1 コラーゲン

项目摘要

(1) 糖転移酵素群によるNOTCHタンパク質の分泌・分解の仕分け機構の解析に向けて、主要な糖転移酵素であるPOFUT1、POGLUT1、EOGTを欠損したHEK293細胞を樹立した。予想通り、この３重変異細胞では、Notch1の細胞膜への発現が消失した。一方、POFUT1、POGLUT1、もしくはEOGTを発現させることにより、Notch1の細胞膜発現が部分的に回復した。従って、３重変異細胞はO型糖鎖の分泌過程における機能を反映することが確認できた。また、３重変異細胞では、O型糖鎖を完全に欠損するのか、一部、残留するO型糖鎖が存在するのかを確かめるために、内在性Notch受容体を免疫沈降により単離し、プロテアーゼ消化産物を質量分析をするための予備実験を実施した。(2) ３重変異細胞におけるNOTCH受容体の局在の異常を明らかにするために免疫染色をしたところ、NOTCH受容体の細胞内への蓄積が観察された。こうした異常NOTCH受容体の分解機構を明らかにするために、プロテアソームやオートファジーの阻害剤を用いて解析したが、異常NOTCH受容体の発現量は、これらの阻害剤により大きな変化は認められなかった。これらの結果より、３重変異細胞におけるNOTCH受容体の分解抵抗性の分子機構を明らかにすることが重要であると考えられた。(３) O型糖鎖欠損NOTCH受容体を認識し、分泌や分解に導く分子機構を明らかにするために、相互作用因子の探索を行った。１つは、BioID法を用いて糖鎖変異型NOTCH1と相互作用する分子を網羅的に同定した。別のアプローチとして、３重変異細胞に発現する内在性NOTCHに相互作用するタンパク質を免疫沈降法により同定した。複数の分子が両グループに共通しており、共通する分子に着目して、機能解析を進めることの有効性が示唆された。

（1）为分析糖基转移酶对Notch蛋白分泌和降解的分类机制，建立了HEK293细胞缺乏主要的糖基转移酶，POFUT1，POGLUT1和EOGT。正如预期的那样，在这个三重突变细胞中，Notch1在细胞膜上的表达丢失。另一方面，pofut1，poglut1或eogt的表达部分恢复了Notch1的细胞膜表达。因此，已经证实，三重突变细胞反映了糖型分泌过程中的功能。此外，在一式三份的突变细胞中，通过免疫沉淀分离内源性缺口受体，以确定O型聚糖是否完全缺乏或是否还有一些O型Glycans，并进行初步实验，以对蛋白酶的蛋白酶消化产物进行大规模分析。（2）进行免疫染色以澄清一式三份细胞中Notch受体的异常定位时，在细胞中观察到Notch受体的积累。为了阐明这些异常缺口受体降解的机制，我们使用蛋白酶体和自噬抑制剂进行了分析，但是由于这些抑制剂，异常缺口受体的表达水平未观察到显着变化。这些结果表明，阐明一式三份突变细胞中Notch受体降解耐药性的分子机制很重要。（3）搜索相互作用的因子，以识别识别O-GlyCan缺陷型凹口受体的分子机制并导致分泌和降解。首先，使用Bioid方法全面鉴定了与糖基化突变体Notch1相互作用的分子。作为另一种方法，通过免疫沉淀鉴定出与在一式三份细胞中表达的内源性缺口相互作用的蛋白质。两组的多个分子都是共同的，这表明进行集中在公共分子上的功能分析的有效性。

项目成果

期刊论文数量（10）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Glycoproteomics of NOTCH1 EGF repeat fragments overexpressed with different glycosyltransferases in HEK293T cells reveals insights into O-GlcNAcylation of NOTCH1

HEK293T 细胞中用不同糖基转移酶过表达的 NOTCH1 EGF 重复片段的糖蛋白组学揭示了对 NOTCH1 O-GlcNAc 酰化的见解

DOI：
10.1093/glycob/cwac015
发表时间：
2022
期刊：
Glycobiology
影响因子：
4.3
作者：
Tsukamoto Yohei;Ogawa Mitsutaka;Yogi Kentarou;Tashima Yuko;Takeuchi Hideyuki;Okajima Tetsuya
通讯作者：
Okajima Tetsuya

O-fucoseとO-glucose修飾はDLK1の効率的な輸送に重要である

O-岩藻糖和 O-葡萄糖修饰对于 DLK1 的有效运输非常重要