Development of Mitochondrial Disease Therapy by Mitochondrial DNA Replacement in Hematopoietic Stem Cells

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mRNA gene transfectionは、Nucleotideの改変、in vitro transcriptionで作成されたmRNAの精製、Transfection法の検討を行った。mRNA Therapeuticsの発展を踏襲し、Pseudouridineの使用とHPLCによる精製を加えることで、従来の方法で認められたIL-1, IL-6, TNF-αなどの炎症性サイトカインの分泌が抑制された。また、Transfectionは、NucleofectorからCAR-T療法でmRNA transfectionにおいてInnate immunityを抑制していると報告のあるMaxCyte社製Electroporatorへの変更による有意な変化を認めることはできず、Nucleofectorを用いた遺伝子導入を基本プロトコールとすることとした。対象細胞はPeliminaryではc-kit+細胞を用いてNZBマウスを用いて置換されたmtDNAの生着をconventional SNP TaqMan qPCR assay及びsc-ddPCR Heteroplasmy assayで確認したところ、ミトコンドリア共培養から1週間ではドナーゲノタイプが50%を越えており、完全置換された細胞も確認された。遺伝子発現変化をRNA seqを用いて解析した結果は、ミトコンドリア呼吸能に関する発現に変化を認めた。移植実験は現在も進行中であるが、血液系の再構築を行った後に、ドナー由来血液系細胞は置換されたミトコンドリアゲノタイプを維持していることが確認された。このミトコンドリアゲノムの安定性の評価及び、その表現系の変化を2年目の検討課題とする。加えて、置換されたミトコンドリアゲノタイプがホスト細胞にいこうしていることが認められ、その移行メカニズムの検討も今後の課題としたい。