ゲノム・エピゲノム編集をもちいたダウン症候群の知的障害に対する遺伝子治療法開発

利用基因组/表观基因组编辑开发针对唐氏综合症相关智力障碍的基因疗法

• 批准号: 22H03039
• 负责人: 北畠 康司
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2027-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03039/
• 关键词: ダウン症候群; 遺伝子治療; ゲノム編集; 知的障害; エピジェネティック編集; iPS細胞

ダウン症候群は21番染色体のトリソミーによって引き起こされる代表的な遺伝性疾患である。申請者らはこれまで、疾患特異的iPS細胞とゲノム編集技術を組み合わせダウン症の中枢神経病態の解析を行ってきた。健常アストロサイトは本来、神経細胞への保護作用をもっており、両者を共培養すると神経細胞のアポトーシスが抑制されるが、ダウン症アストロサイトではこの保護作用が消失するばかりか、神経細胞に過剰なアポトーシスを誘導してしまう。ダウン症アストロサイトでは自然免疫の重要な鍵を握る“NLRP3インフラマソーム”の活性が著しく上昇していること、さらにその責任遺伝子として、21番染色体上のDYRK1A を同定することに成功した。そこで本研究課題ではこのDYRK1Aに注目し、ゲノム編集・エピジェネティック編集をもちいることでその発現量を抑制することによる治療法開発を目指している。真下らによって開発された新しいゲノム編集技術であるCRISPR-Cas3は、数塩基の切断しか行わないCas9とは異なり、最大数十kbもの大規模な塩基欠失を引き起こすという大きな特徴をもち、またオフターゲット効果がCRISPR-Cas9と比較して低い。そこでDYRK1Aの3アレルのうちの1つだけがもつSNPと組み合わせてCRISPR-Cas3を作用させることで、DYRK1Aの正確なコピー数補正を試みた。また、切断活性を失くしたdead Cas9 (dCas9)に転写制御因子やヒストン修飾酵素を融合させ、DNAメチル化を変化させることで標的領域の遺伝子発現を自由に制御することのできるエピジェネティック編集を用いて、DYRK1Aの発現制御を試みた。その結果、in vitroにおいていずれもDYRK1Aの発現量低下を確認することができた。

唐氏综合症是由21染色体三体造成的典型遗传性疾病。申请人以前已将特异性IPS细胞与基因组编辑技术组合在一起，以分析唐氏综合症中枢神经系统病理学。健康的星形胶质细胞自然会对神经元具有保护作用，并且它们的共培养抑制神经元的凋亡，但唐氏综合征的星形胶质细胞不仅消除了这种保护作用，而且还会诱导神经元中的细胞凋亡过多。在唐氏综合症的星形胶质细胞中，“ NLRP3炎性体”的活性是具有先天免疫力的重要关键的，它已显着增加，我们成功地识别了21号染色体上的DyRK1a作为负责的基因。因此，该研究主题的重点是DYRK1A，并旨在通过使用基因组编辑和表观遗传学编辑来抑制其表达水平来开发治疗方法。与CAS9仅分解几个基础不同，Masashira等人开发的一种新的基因组编辑技术CRISPR-CAS3的主要特征是导致大量基本删除量高达数十KB，其脱离态度效果低于CRISPR-CAS9。因此，我们试图通过将CRISPR-CAS3与DYRK1A的三个等位基因中的一个相结合的SNP结合来纠正DYRK1A的拷贝数。此外，我们试图使用表观遗传编辑来控制DyRK1a的表达，这允许转录调节剂和组蛋白修饰酶融合到死亡CAS9（DCAS9）（DCAS9），后者失去了其裂解活性，并允许通过改变DNA甲基化的DNA甲基化来自由控制靶区域的表达。结果，已经证实了dyRK1a的表达水平在体外降低。