Development of gene-based therapeutic approach for Down syndrome using novel genome editing technology

利用新型基因组编辑技术开发基于基因的唐氏综合症治疗方法

• 批准号: 21K19448
• 负责人: 北畠 康司
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19448/
• 关键词: ダウン症候群; ゲノム編集; 遺伝子治療; iPS細胞; アストロサイト

ダウン症候群では、21番染色体トリソミーにより重篤な知的障害と認知障害が起こる。我々はダウン症候群のアストロサイトではNLRP3インフラマソームの活性が亢進し、神経細胞に強い変性細胞死をもたらし、かつその原因遺伝子がDYRK1Aであることを明らかにした。本研究ではそのコピー数を正確に修正するために、新規のゲノム編集技術CRISPR-Cas3に注目し、アレル特異的SNPを用いてDYRK1Aのアレル選択的コピー数修正を行うことを目指している。昨年度は、あるダウン症児の臍帯血に由来するiPS細胞のゲノム配列を精査し、DYRK1Aの3つのアレルのうち1つだけに存在するSNPを見出すことに成功した。そこで今年度はこの領域を含んだguide RNAを作成し、iPS細胞においてCRISPR-Cas3を作用させてみたところ、DYRK1Aのゲノム量を減少させることに成功した。さらにiPS細胞から分化誘導したアストロサイトにおいてCRISPR-Cas3を投与した。エクソン3，4においてゲノム量の減少を確認することができ、かつ反対方向のエクソン5では減少が見られなかった。このアストロサイトではDYRK1Aの発現量の低下を確認した。重要なことは、SNPをもたないguide RNAではゲノム量の低下より強く見られ、またSNPを持たないiPS細胞に対してSNPをもつguide RNAを作用させても変化は見られないことから、特異性を確認することができた。来年度はさらに神経細胞・アストロサイト共培養系をもちいて、神経細胞への影響を確認する。

在唐氏综合症中，21染色体三体染色体会导致严重的智力和认知障碍。我们已经透露，唐氏综合症的星形胶质细胞中NLRP3炎性体的活性增加，导致神经元中强烈的退化细胞死亡，而因果基因是dyrk1a。在这项研究中，我们专注于新型的基因组编辑技术CRISPR-CAS3，以准确纠正其拷贝数，并旨在使用等位基因特异性SNP对DYRK1A进行等位基因选择性拷贝数修改。去年，我们检查了唐氏综合症儿童的脐带血的IPS细胞的基因组序列，并成功发现了仅在DyRK1a的三个等位基因之一中存在的SNP。因此，今年我们创建了包含该区域的指南RNA并在IPS细胞上使用CRISPR-CAS3，并设法减少了DYRK1A基因组的量。此外，将CRISPR-CAS3用于与IPS细胞不同的星形胶质细胞。在外显子3和4中证实了基因组含量的降低，并且在相反方向的外显子5中未观察到降低。该星形胶质细胞证实了dyRK1a的表达水平降低。重要的是，没有SNP的引导RNA比基因组含量降低更为明显，并且当使用具有SNP的IPS RNA的引导RNA时，没有观察到任何变化，这表明可以证实特异性。明年，我们将进一步使用神经元和星形胶质细胞共培养系统来确认对神经元的影响。