Comprehensive analysis on Wnt signaling pathway to develop a novel signal modifier

マウス骨芽細胞由来MC-3T3細胞の内在性に発現する全てのFzd（10種類）および共受容体（LDL受容体ファミリーに属するLrp5/6、およびRTKであるRor1/2、Ryk、Ptk7の共受容体6種類）を、CRISPR-Cas9を利用して欠失させた細胞株E1-NR細胞を樹立した。各遺伝子のゲノム配列を確認し、いずれもフレームシフト変異・停止コドンがコード領域内に挿入されることを確認している。E1-NR細胞に対して、Wnt 19種類、Fzd 10種類、および共受容体 6種類をアデノウィルスを用いて一過性に発現させ、下流シグナル経路(GPCR経路、PCP経路、β-カテニン経路)の応答性を、NanoLucレポーターシステムを用いて網羅的に測定することで、本研究の基盤となる包括的なデータ取得を行う。本年度は、β-カテニン経路に関してのデータ取得を実施した。E1-NR細胞においては、Lrp5、Lrp6、あるいはその両方を導入した条件下でのみ、β-カテニン経路（TCFレポーターを用いて評価）の活性化が確認され、既報にある通り、Lrp5/6とFzdとの架橋構造がシグナルの起点となっていることが確認された。さらに、特定のWnt-Fzdの組み合わせにおいてのみ、β-カテニン経路の強い活性化が認められ、これまでに十分な情報が得られていなかったFzd側の選択性に関して有用な知見が得られた。上記と並行して、β-カテニン経路に対してシグナル入力を可能とする改変抗体の構築を試みている。Lrp5/6、および今回の解析で特に強いシグナル受容能を示したFzd分子2種類に関して、細胞外ドメインにFcタグを付与した組み換えタンパク質の産生・精製を完了した。今後、これらをベイトとしたファージディスプレイ法によって高親和性に結合するscFvを単離し、選択的なシグナル誘導能を示す改変抗体の分子構造を探索する。

マウス骨芽細胞由来MC-3T3細胞の内在性に発現する全てのFzd（10種類）および共受容体（LDL受容体ファミリーに属するLrp5/6、およびRTKであるRor1/2、Ryk、Ptk7の共受容体6種類）を、CRISPR-Cas9を利用して欠失させた細胞株E1-NR細胞を樹立した。各遺伝子のゲノム配列を確認し、いずれもフレームシフト変異・停止コドンがコード領域内に挿入されることを確認している。E1-NR細胞に対して、Wnt 19種類、Fzd 10種類、および共受容体 6種類をアデノウィルスを用いて一過性に発現させ、下流シグナル経路(GPCR経路、PCP経路、β-カテニン経路)の応答性を、NanoLucレポーターシステムを用いて網羅的に測定することで、本研究の基盤となる包括的なデータ取得を行う。本年度は、β-カテニン経路に関してのデータ取得を実施した。E1-NR細胞においては、Lrp5、Lrp6、あるいはその両方を導入した条件下でのみ、β-カテニン経路（TCFレポーターを用いて評価）の活性化が確認され、既報にある通り、Lrp5/6とFzdとの架橋構造がシグナルの起点となっていることが確認された。さらに、特定のWnt-Fzdの組み合わせにおいてのみ、β-カテニン経路の強い活性化が認められ、これまでに十分な情報が得られていなかったFzd側の選択性に関して有用な知見が得られた。上記と並行して、β-カテニン経路に対してシグナル入力を可能とする改変抗体の構築を試みている。Lrp5/6、および今回の解析で特に強いシグナル受容能を示したFzd分子2種類に関して、細胞外ドメインにFcタグを付与した組み換えタンパク質の産生・精製を完了した。今後、これらをベイトとしたファージディスプレイ法によって高親和性に結合するscFvを単離し、選択的なシグナル誘導能を示す改変抗体の分子構造を探索する。