軟骨細胞分化の連続性を制御する階層的遺伝子発現ネットワークの解明

2022年度はシングルセルRNA-seqの解析と、シングルセルATAC-seqのデータ抽出を行った。まず、Col11-Enh-CreマウスとROSA26-CAG-LSL-ZsGreenマウスを交配し、軟骨細胞がZsGreenで標識されたCol11-Enh-ZsGreenマウスを作製した。全ての分化段階の成長板軟骨細胞が出現する胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理により1細胞レベルまで分離した後、セルソーターを用いてZsGreen陽性細胞、すなわち成長板軟骨細胞のみを回収し、10xChromiumシステムを用いてscRNA-seqを行った。次世代シークエンサーにより得られたデータを解析し、成長板軟骨細胞の全ての細胞のクラスタリングとその特異的遺伝子を抽出した結果、成長板軟骨細胞を従来の４段階ではなく、分化移行期を含む８つの細胞集団に分類し、それぞれのマーカー遺伝子を同定することに成功した。次に、同様のアプローチで胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理からセルソーターによる細胞回収を行ったのち、ジギトニン処理を４分間行うことで細胞核の抽出を行った。すべての細胞核をバルクでトランスポーズ処理した後、Chromium Controllerで10xバーコードがついたゲルビーズを加えてトランスポーズ処理したDNA断片を10xバーコードでラベルした。最終的に、次世代シークエンサーで解析を行いシングルセルATAC-seqデータとして抽出した。

2022年度はシングルセルRNA-seqの解析と、シングルセルATAC-seqのデータ抽出を行った。まず、Col11-Enh-CreマウスとROSA26-CAG-LSL-ZsGreenマウスを交配し、軟骨細胞がZsGreenで標識されたCol11-Enh-ZsGreenマウスを作製した。全ての分化段階の成長板軟骨細胞が出現する胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理により1細胞レベルまで分離した後、セルソーターを用いてZsGreen陽性細胞、すなわち成長板軟骨細胞のみを回収し、10xChromiumシステムを用いてscRNA-seqを行った。次世代シークエンサーにより得られたデータを解析し、成長板軟骨細胞の全ての細胞のクラスタリングとその特異的遺伝子を抽出した結果、成長板軟骨細胞を従来の４段階ではなく、分化移行期を含む８つの細胞集団に分類し、それぞれのマーカー遺伝子を同定することに成功した。次に、同様のアプローチで胎生期15日目のCol11-Enh-ZsGreenマウスの四肢をコラゲナーゼ処理からセルソーターによる細胞回収を行ったのち、ジギトニン処理を４分間行うことで細胞核の抽出を行った。すべての細胞核をバルクでトランスポーズ処理した後、Chromium Controllerで10xバーコードがついたゲルビーズを加えてトランスポーズ処理したDNA断片を10xバーコードでラベルした。最終的に、次世代シークエンサーで解析を行いシングルセルATAC-seqデータとして抽出した。