時空間的トランスクリプトミクスによる骨格系幹細胞の運命決定機構の解明

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2022年度は10xGenomics社によってプラットフォーム化され市販されているVisium空間的遺伝子発現解析システムを用いて空間的トランスクリプトミクスを中心に解析を行った。まずはじめにE14.5マウス脛骨の凍結切片から、スライド上のDNAスポットへRNAを抽出するための細胞透過酵素の反応時間を検討し、酵素処理時間を60分とした。そして、Visium Gene ExpressionスライドにE14.5マウス脛骨の凍結切片を貼付し、スライドの位置情報を含んだDNAバーコードを持ったライブラリーが作製される。得られたライブラリーを3億ペアリード/サンプルで解析し、10X GenomicsのソフトウェアであるSpace Ranger解析パイプランとLoupe Browserによる可視化を行い、E14.5マウス脛骨の遺伝子発現マップを作製した。その結果、脛骨の細胞群を遺伝子発現により9つの細胞クラスターに分類することに成功した。そして、筋肉組織および皮膚組織を除外し骨組織のみを指定し再クラスタリングを行うとともに、細胞クラスターを脛骨の組織切片と比較し空間的情報とをオーバーラップさせた。最終的に、成長板軟骨の骨端部に骨格系幹細胞と推測される細胞集団を見出した。これらの細胞クラスターに特異的な遺伝子を抽出したところ、Barx1、GDF5、Ccn3などが同定され、重用なことに昨年度シングルセルRNA-seqにおいて骨格系幹細胞と推測された遺伝子群と一致していた。また、これまで不明な点が多かった肥大化軟骨細胞に特異的な遺伝子群も検出することに成功した。