Muliple nicks-induced interhomolog recombination

多个切口诱导的同源间重组

• 批准号: 22H03741
• 负责人: 中田 慎一郎
• 金额: $ 10.9万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03741/
• 关键词: ニック; 相同染色体間組換; 複製; ゲノム編集; 遺伝子治療; 相同組換え; CRISPR/Cas9; DNA1本鎖切断; 相同染色体

DNA2本鎖切断（DSB）の修復経路の一つとして相同組み換えがある。多くの場合、姉妹染色分体を鋳型とした正確なDNA修復が行われる。相同染色体を鋳型とする修復が起こる場合には、ヘテロ接合性が喪失する危険がある。しかし、頻度が極めて低いため、これまで重視されなかった。最近、申請者らは、両方の相同染色体にDNA1本鎖切断（SSB）であるニックが発生した場合、DSB発生時を大きく上回る頻度で相同染色体間組換え（IHR）が発生することを発見した。Cas9D10AとsgRNAを用いてゲノム上に部位特異的なニックを発生させることでIHRを誘導した。既知のDNA修復に関与する遺伝子のノックアウト、ノックダウン細胞において、ニック誘導型IHR（N-IHR）の効率を測定した。N-IHRにどの既知遺伝子がどの程度関与するのか明らかとなってきた。一方で、DSBのHRには必須にもかかわらず、N-IHR効率に全く影響を及ぼさない遺伝子も存在する。N-IHRでは、遺伝子変異やシングルヌクレオチドポリモルフィズム（SNP）を利用して、アレル特異的なニック（野生型配列にはニックを発生させない）を発生させると、変異およびSNPは野生型に変換される。この特徴を生かし、多様な遺伝子において、N-IHRの誘導を実施している。Cas9-ガイドRNAの標的特異性は、すなわちオフターゲット認識をしやすいかどうかと同義である。しかし、遺伝子変異・SNP配列がCas9D10AsgRNAの標的となり、対立遺伝子上の配列はオフターゲット認識がされにくくなるようにガイドRNAをデザインしても、遺伝子変異・SNP配列に対する特異性が示されない場合が多く存在することが明らかとなってきている。

DNA2 lock cut (DSB) <s:1> repair channel <e:1> one と と て て the same set み replace えがある. In many く <s:1> occasions, 姉 sister staining, separate を casting type と <s:1> た correct なDNA repair が row われる. The same chromosome を type where と す る repair が こ る occasions に は, ヘ テ ロ joint loss of sexual が す る dangerous 険 が あ る. The frequency is が extremely めて low ため ため, <s:1> れまで attach great importance to されな った った. Recently, applicants ら は, struck の same chromosome に DNA1 this lock cut off (SSB) で あ る ニ ッ ク が 発 raw し た occasions, DSB 発 を when born big き く る last time frequency で between chromosome group in same え (IHR) が 発 raw す る こ と を 発 see し た. Cas9D10A と sgRNA を with い て ゲ ノ ム に parts on specific な ニ ッ ク を 発 raw さ せ る こ と で IHR を induced し た. Both know の DNA repair に masato and す る heritage 伝 son の ノ ッ ク ア ウ ト, ノ ッ ク ダ ウ ン cells に お い て, ニ ッ ク induction type IHR (N - IHR) の を sharper rate determination し た. The degree of N-IHRに <s:1> <e:1> is related to the degree of 伝 seeds が <e:1> and する <s:1> する, ら ら, となって, た た. Side で, DSB の HR に は must に も か か わ ら ず, N - their working rate に く influence を and ぼ さ な い heritage 伝 son も exist す る. N - IHR で は, heritage 伝 sub - different や シ ン グ ル ヌ ク レ オ チ ド ポ リ モ ル フ ィ ズ ム (SNP) を using し て, ア レ ル specific な ニ ッ ク (wild type with column に は ニ ッ ク を 発 raw さ せ な い) を 発 raw さ せ る と, - different お よ び SNP は wild-type に variations in さ れ る. The characteristics of the <s:1> <s:1> are を to produce <s:1>, multiple な offspring 伝 にお て て, N-IHR <s:1> to induce を to apply て る る る. Cas9 - ガ イ ド RNA の target specificity は, す な わ ち オ フ タ ー ゲ ッ ト know を し や す い か ど う か と synonymous で あ る. し か し, but 伝 sub - different SNPS with column が Cas9D10AsgRNA の mark と な り, moral heritage in の 伝 match column は オ フ タ ー ゲ ッ ト know が さ れ に く く な る よ う に ガ イ ド RNA を デ ザ イ ン し て も, but 伝 sub - different SNPS with column に す seaborne る specificity が shown さ れ な い occasions が す more く る こ と が Ming ら か Youdaoplaceholder0 となって て て る る.

项目成果

DNA1本鎖切断（ニック）によるlong deletion誘導

DNA 单链断裂（切口）诱导长缺失

• 发表时间: 2022
• 作者: 富田亜希子;中田慎一郎
• 通讯作者: 中田慎一郎

Gene correction by nicks-induced interhomolog recombination and genomic deletion

通过切口诱导的同源重组和基因组缺失进行基因校正

• 发表时间: 2022
• 作者: Shinichiro Nakada;Akiko Tomita;Hiroyuki Sasanuma;Tomoo Ogi
• 通讯作者: Tomoo Ogi

マルチプルニックによる相同染色体間組換え

通过多个切口的同源染色体间重组

• 发表时间: 2022
• 作者: 中田慎一郎;富田亜希子
• 通讯作者: 富田亜希子