Muliple nicks-induced interhomolog recombination

DNA2本鎖切断（DSB）の修復経路の一つとして相同組み換えがある。多くの場合、姉妹染色分体を鋳型とした正確なDNA修復が行われる。相同染色体を鋳型とする修復が起こる場合には、ヘテロ接合性が喪失する危険がある。しかし、頻度が極めて低いため、これまで重視されなかった。最近、申請者らは、両方の相同染色体にDNA1本鎖切断（SSB）であるニックが発生した場合、DSB発生時を大きく上回る頻度で相同染色体間組換え（IHR）が発生することを発見した。Cas9D10AとsgRNAを用いてゲノム上に部位特異的なニックを発生させることでIHRを誘導した。既知のDNA修復に関与する遺伝子のノックアウト、ノックダウン細胞において、ニック誘導型IHR（N-IHR）の効率を測定した。N-IHRにどの既知遺伝子がどの程度関与するのか明らかとなってきた。一方で、DSBのHRには必須にもかかわらず、N-IHR効率に全く影響を及ぼさない遺伝子も存在する。N-IHRでは、遺伝子変異やシングルヌクレオチドポリモルフィズム（SNP）を利用して、アレル特異的なニック（野生型配列にはニックを発生させない）を発生させると、変異およびSNPは野生型に変換される。この特徴を生かし、多様な遺伝子において、N-IHRの誘導を実施している。Cas9-ガイドRNAの標的特異性は、すなわちオフターゲット認識をしやすいかどうかと同義である。しかし、遺伝子変異・SNP配列がCas9D10AsgRNAの標的となり、対立遺伝子上の配列はオフターゲット認識がされにくくなるようにガイドRNAをデザインしても、遺伝子変異・SNP配列に対する特異性が示されない場合が多く存在することが明らかとなってきている。

DNA2本鎖切断（DSB）の修復経路の一つとして相同組み換えがある。多くの場合、姉妹染色分体を鋳型とした正確なDNA修復が行われる。相同染色体を鋳型とする修復が起こる場合には、ヘテロ接合性が喪失する危険がある。しかし、頻度が極めて低いため、これまで重視されなかった。最近、申請者らは、両方の相同染色体にDNA1本鎖切断（SSB）であるニックが発生した場合、DSB発生時を大きく上回る頻度で相同染色体間組換え（IHR）が発生することを発見した。Cas9D10AとsgRNAを用いてゲノム上に部位特異的なニックを発生させることでIHRを誘導した。既知のDNA修復に関与する遺伝子のノックアウト、ノックダウン細胞において、ニック誘導型IHR（N-IHR）の効率を測定した。N-IHRにどの既知遺伝子がどの程度関与するのか明らかとなってきた。一方で、DSBのHRには必須にもかかわらず、N-IHR効率に全く影響を及ぼさない遺伝子も存在する。N-IHRでは、遺伝子変異やシングルヌクレオチドポリモルフィズム（SNP）を利用して、アレル特異的なニック（野生型配列にはニックを発生させない）を発生させると、変異およびSNPは野生型に変換される。この特徴を生かし、多様な遺伝子において、N-IHRの誘導を実施している。Cas9-ガイドRNAの標的特異性は、すなわちオフターゲット認識をしやすいかどうかと同義である。しかし、遺伝子変異・SNP配列がCas9D10AsgRNAの標的となり、対立遺伝子上の配列はオフターゲット認識がされにくくなるようにガイドRNAをデザインしても、遺伝子変異・SNP配列に対する特異性が示されない場合が多く存在することが明らかとなってきている。