DNA1本鎖損傷により誘導される染色体構造異常発生機構の解明

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染色体構造異常は悪性腫瘍で多く認められる。染色体構造異常の種類は様々であるが、異なる2つの染色体が融合する染色体転座や染色体上で大きな領域が欠失してヘテロ接合性の喪失に至ることがある。一方、gain of functionやdominant negative効果が原因となるAutosomal Dominant疾患において、変異アレル特異的に大規模欠失を発生させることができれば、その疾患が治癒する可能性がある。DNA2本鎖切断（DSB）を用いずにDNA1本鎖切断であるニックを用いて、目的外変異が発生しないようにlong deletionを発生させ、その分子機構の解明や正確性の検証を行ってきた。昨年度に引き続き、DNA2本鎖のそれぞれに1カ所ずつニックを発生させることにより、long deletionの誘導を行った（以下MN-LD法）。昨年度検証に用いた遺伝子に加え、X染色体上の遺伝子（使用した細胞は男性由来の細胞）において、MN-LD法を実施し、約50%の細胞においてlong deletionを発生させることができた。また、遺伝子Aの5′UTRにおいてcoding鎖に、3′UTRにおいてnon-coding鎖にニックを発生せさせたところ、計画通りのlong deletionの発生が確認され、遺伝子全長の削除も可能であることが示された。ニッカーゼとsgRNA2種類を組み合わせた場合、野生型Cas9とsgRNA2種類を組み合わせた場合とに分け実験を実施した。シングルセル由来クローンを作成し、long deletionが発生した細胞において遺伝子のbreakpointの特徴をサンガーシーケンス法により解析した。その結果、マイクロホモロジーが検出される割合が高いことが示された。DSBを2カ所発生させて同様の実験を実施した場合には、マイクロホモロジーの頻度はこれよりも低く、DNA損傷の種類によりDNA断端の結合様式が異なることが示された。