权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

急速凍結X線吸の収スペクトル法による錯体、金属タンパク質の反応過程の解析

利用速冻X射线吸收光谱分析配合物与金属蛋白的反应过程

基本信息

批准号：
04215221
负责人：
西郷敏
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までの研究で、ミオグロビンの反応中間体のX線吸収スペクトルを急速凍結法により測定し、その構造上の特徴を明かにすることが出来た。本年度は、亜鉛を含むタンパク質分解酵素であるカルボキシペプチダーゼA(CPA)について、その酵素基質複合体を同様の方法で調べた。基質としては、反応の過程を、可視部の蛍光強度の変化で追跡できるダンシル-アラニル-アラニル-フェニルアラニンを用いた。この基質とCPAの反応過程はストップトフロー法により、Auldらのグループにより詳しく調べられ、(1)CPAと基質の混合直後に一つの複合体ES_1が生成し、(2)その後の速い過程によりもう一つの複合体ES_2が生じ、(3)これに続く遅い過程で、基質が分解されることが分かった。反応を遅くし、途中に現れる中間体を十分に蓄積するために、凍結防止剤NaNO_3の共在下、-15℃の低温で反応を観測した。その結果、上に述べたような過程を確認することが出来た。つぎの、反応の開始後、(a)7msと(b)0.6sの時点で急速凍結を行い、得られた試料のZn-k吸収端のX線吸収スペクトルを測定した。(a)と(b)の時点でCPAはそれぞれ主としてES_1とES_2の状態にあると思われる。XANES領域におけるスペクトル(a)は、単独の酵素のスペクトルに良く似ていた。このことはES_1がいわゆるミカエリス複合体であって、基質と亜鉛原子は直接の相互作用をしていないことを意味する。一方、これらに比べ、XANES領域におけるスペクトル(b)は、主ピークが鋭く幅が狭い。金属原子の配位数が4配位から5配位または6配位になるとK吸収端の主ピークが鋭くなるとともに高さが増大することがいくつかの化合物で報告されている。このことから、ES_2の状態では、単独の酵素に比べて、金属まわりの対称性が増加している可能性がある。X線結晶解析の結果に基づいて提案されている反応機構と以上の結果の関連は今後の研究課題である。

The X-ray absorption spectra of the reaction intermediates in the reaction system were determined by the rapid freezing method and the structural characteristics of the reaction intermediates were clarified. This year, the enzyme matrix complex was adjusted in the same way as the enzyme matrix complex. The substrate is in the process of reflection, and the visible part is in the process of changing the intensity of light. (1) The complex ES_1 is formed after CPA and substrate are mixed;(2) The complex ES_2 is formed after CPA and substrate are mixed;(3) The complex ES_2 is formed after CPA and substrate are decomposed. The reaction temperature is-15℃, and the intermediate is very low in temperature. The result of the above discussion is confirmed. The X-ray absorption spectra of Zn-k absorption end of sample were measured at the time point of rapid freezing (a)7ms and (b) 0.6 s after the start of reaction. (a)(b) The time point of CPA is opposite to that of ES_1 and ES_2. XANES field selection criteria (a), single enzyme selection criteria (b) The interaction between lead atoms and matrix elements in a complex is significant. One side, the other side, the XANES field, the other side, the main side, the sharp side. The coordination number of the metal atom is 4-coordinated, 5-coordinated, 6-coordinated, and the absorption end of the K atom is sharp and high. The state of ES_2 is different, the ratio of enzyme to metal is higher, and the compatibility of metal is higher. The results of X-ray crystallographic analysis are based on the proposed mechanism and the relationship between the above results and future research topics.