ラット3Y1細胞の温度感受性細胞周期変異株の変異遺伝子の単離とその機能の解析

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tsD123細胞はラット正常線維芽細胞株3Y1由来の39.8°Cの制限温度でG1期で可逆的に増殖停止する温度感受性変異株である。tsD123細胞の変異遺伝子に対応する正常遺伝子を単離し、その機能と発現調節を調べ、G0/G1期での増殖制御機構に関する重要な知見を得ことをこの研究の最終目標とする。tsD123細胞をSV40でトランスホームしたSV-tsD123細胞に、発現ベクターに組み込まれたヒト線維芽細胞cDNAライブラリーを導入し、制限温度で増殖できる一次復帰細胞株を分離し、この細胞のDNAを再びSV-tsD123に導入し、二次復帰細胞株を分離した。二次復帰細胞株とCOS細胞とを細胞融合して(ここで用いたcDNAライブラリーのベクター部分はSV40の複製開始領域を含む)、二次復帰細胞株のDNAに組み込みれているcDNAライブラリーDNAをプラスミドとして回収した。それらのプラスミドの内、cDNAライブラリーの共通マーカーであるneo遺伝子と1.8kbの挿入cDNAとを含むプラスミドをtsD123細胞に導入すると、G418耐性になった細胞株の内、ほぼ半数の株が温度耐性であった。温度耐性になっていない細胞株のDNAにはneo遺伝子が組み込まれていたが、1.8kbの挿入cDNAは組み込まれていなかった。また温度耐性に復帰した細胞株では、獲得した温度耐性の程度に応じてこの挿入cDNAのmRNAレベルででの発現が上昇していた。したがってこの1.8kbの挿入cDNAはtsD123の温度感受性の機能を相補する遺伝子を含むと考えられる。単離したcDNAの塩基配列を調べた結果、予相される蛋白は336個のアミノ酸を有する39.1kbの蛋白であり、既存の遺伝子には相当するものが無いことが分かった。このcDNAの予相蛋白をコードする部分をpETベクターにつないで、大腸菌で17個のアミノ酸のペプチドとの融合蛋白として発現させると、約45kbの蛋白が大量に得られた。現在この融合蛋白に対する抗体を作製中である。