ラット3Y1細胞の温度感受性細胞周期変異株の変異遺伝子の分離とその機能の解析

ラット二倍体正常線維芽細胞株3Y1から分離されたG1期温度感受性変異株の一つであるtsD123の欠損機能を補う遺伝子を単離すことを試みた。許容温度から制限温度に移すと、tsD123は可逆的に増殖停止するのに対し、この細胞をSV40でトランスホ-ムして得たSVーtsD123は急激に死ぬため、SVーtsD123に相補遺伝子を導入して温度耐性への復帰株の単離が容易にできると予想した。SVーtsD123細胞に、増殖状態にあるヒト線維芽細胞に発現している遺伝子のcDNAライブラリ-(阪大、岡山教授より分与)を導入して制限温度で増殖できる細胞株を7株分離した。この7株の細胞からそれぞれDNAを調整して再びSVーtsD123に導入して、もとの導入cDNAライブラリ-のマ-カ-であるG418耐性を持ちかつ温度耐性に復帰した細胞株(二次復帰細胞株)を3株分離した。これらの二次復帰細胞株とCOS細胞(ラ-ジT抗原を産生するSV40の許容細胞)とを細胞融合して(cDNAライブラリ-のベクタ-部分はSV40の複製開始領域を含む)培養し、その細胞破壊液を大腸菌に導入して二次復帰細胞のDNAに組み込まれているプラスミドを回収することを試みたところ、1.7kbの挿入遺伝子を有するプラスミドの回収に成功した。サザンブロットでこの1.7kbの遺伝子は上記の3つの二次復帰株のDNAに組み込まれているが、SVーtsD123のDNAには組み込まれていないことを確認した。この1.7kbの遺伝子が挿入されたプラスミドをSVーtsD123に導入して制限温度で増殖する細胞に戻ることを確認した。したがってこの1.7kbの挿入遺伝子はSVーtsD123の温度感受性の機能を相補する遺伝子であると考えられる。今後3Y1細胞におけるこの遺伝子に対応する遺伝子の単離およびその産物の抗体の作成を行い、この遺伝子の機能と細胞周期移行の調節との関係を明かにしてゆきたい。

ラット二倍体正常線維芽細胞株3Y1から分離されたG1期温度感受性変異株の一つであるtsD123の欠損機能を補う遺伝子を単離すことを試みた。許容温度から制限温度に移すと、tsD123は可逆的に増殖停止するのに対し、この細胞をSV40でトランスホ-ムして得たSVーtsD123は急激に死ぬため、SVーtsD123に相補遺伝子を導入して温度耐性への復帰株の単離が容易にできると予想した。SVーtsD123細胞に、増殖状態にあるヒト線維芽細胞に発現している遺伝子のcDNAライブラリ-(阪大、岡山教授より分与)を導入して制限温度で増殖できる細胞株を7株分離した。この7株の細胞からそれぞれDNAを調整して再びSVーtsD123に導入して、もとの導入cDNAライブラリ-のマ-カ-であるG418耐性を持ちかつ温度耐性に復帰した細胞株(二次復帰細胞株)を3株分離した。これらの二次復帰細胞株とCOS細胞(ラ-ジT抗原を産生するSV40の許容細胞)とを細胞融合して(cDNAライブラリ-のベクタ-部分はSV40の複製開始領域を含む)培養し、その細胞破壊液を大腸菌に導入して二次復帰細胞のDNAに組み込まれているプラスミドを回収することを試みたところ、1.7kbの挿入遺伝子を有するプラスミドの回収に成功した。サザンブロットでこの1.7kbの遺伝子は上記の3つの二次復帰株のDNAに組み込まれているが、SVーtsD123のDNAには組み込まれていないことを確認した。この1.7kbの遺伝子が挿入されたプラスミドをSVーtsD123に導入して制限温度で増殖する細胞に戻ることを確認した。したがってこの1.7kbの挿入遺伝子はSVーtsD123の温度感受性の機能を相補する遺伝子であると考えられる。今後3Y1細胞におけるこの遺伝子に対応する遺伝子の単離およびその産物の抗体の作成を行い、この遺伝子の機能と細胞周期移行の調節との関係を明かにしてゆきたい。