植物オルガネラDNAの複製開始機構

タバコ培養細胞BY2を用い、プロブラスチドDNAの複製開始領域を決定した。この培養細胞の定常期細胞を新鮮培地に移植すると、核DNA合成に先行してプロブラスチドDNA合成が始まる。この時期の細胞から、プロプラスチドDNAを単離し、DNA複製中間体に富む画分を調製した。この画分をプローブとしてハイブリダイゼーションを行なったところ、プロプラスチドDNA中の約30KbのInverted Repeat由来の断片に強くハイブクダイズした。この結果から、Inverted Repeat内の領域で複製が開始されることが示唆された。更に、複製中間体の電子顕微鏡観察を行ない、D-ループの位置から複製開始領域がInverted Repeatの末端近くにあること、複製は両方向に進むこと、2ケ所存在する同一の塩基配列を有する領域がin ofvoで共に複製を開始させることが明らかになった。現在、この領域を含むプラスミドをパーティクルガンを用いて、プロプラスチド中に導入することを試みている。薬剤耐性をマーカーとして用いることができないため、プロプラスチドDNAを回収後、大腸菌に形質転換してアッセイしている。各種プラスミドDNAを用いた実験において、回収されたプラスミドDNAは最初のプラスミドとは全く異なっていた。これは、プロプラスチド中でDNAの組換が高頻度で起きたことが原因であると考えられる。この組換プラスミドは最初に用いたプラスミドの10分の1の大きさのインサートした持っていない。この組換プラスミドがプロプラスチド中で複製できるかどうか検討中である。

タバコ培養細胞BY2を用い、プロブラスチドDNAの複製開始領域を決定した。この培養細胞の定常期細胞を新鮮培地に移植すると、核DNA合成に先行してプロブラスチドDNA合成が始まる。この時期の細胞から、プロプラスチドDNAを単離し、DNA複製中間体に富む画分を調製した。この画分をプローブとしてハイブリダイゼーションを行なったところ、プロプラスチドDNA中の約30KbのInverted Repeat由来の断片に強くハイブクダイズした。この結果から、Inverted Repeat内の領域で複製が開始されることが示唆された。更に、複製中間体の電子顕微鏡観察を行ない、D-ループの位置から複製開始領域がInverted Repeatの末端近くにあること、複製は両方向に進むこと、2ケ所存在する同一の塩基配列を有する領域がin ofvoで共に複製を開始させることが明らかになった。現在、この領域を含むプラスミドをパーティクルガンを用いて、プロプラスチド中に導入することを試みている。薬剤耐性をマーカーとして用いることができないため、プロプラスチドDNAを回収後、大腸菌に形質転換してアッセイしている。各種プラスミドDNAを用いた実験において、回収されたプラスミドDNAは最初のプラスミドとは全く異なっていた。これは、プロプラスチド中でDNAの組換が高頻度で起きたことが原因であると考えられる。この組換プラスミドは最初に用いたプラスミドの10分の1の大きさのインサートした持っていない。この組換プラスミドがプロプラスチド中で複製できるかどうか検討中である。