線虫の興奮一収縮連関におけるカルシウムチャンネル遺伝子の構造と機能

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ウサギのリアノジン受容体cDNA断片を用いて、線虫のリアノジン受容体遺伝子のcDNAの膜貫通領域をクローン化した。線虫の伊理的染色体地図上の第V染色体左側に位置づけ、当該コモミドクローンを解析して、約60%(16kb)のリアノジン受容体遺伝子構造を明らかにした。なお、クローン化した線虫のcDNAは未発表の段階でショウジョウバエのリアノジン受容体遺伝子クローニングのために供与された。1)転写産物の同定とcDNAクローン解析:cDNAライブラリーをスクリーニングし、4つ得られたcDNAの塩基配列を決定したアミノ酸に翻訳したところ、ウサギのリアノジン受容体の膜貫通領域と高い相同性が見られた。クローン化したcDNAをプローブに用いてノーザン解析を行いリアノジン受容体遺伝子の転写産物の大きさを求めたところ、哺乳類と同様に約15kbであった。2)遺伝子座位の決定と突然変異体:線虫の全染色体を含む、YACライブラリーを検索して、線虫のリアノジン受容体遺伝子を物理的染色体地図上の第V染色体左側に位置づけた。物理的染色体地図上から推定した遺伝子座位に突然変異体は単離されてなかった。ゲノムサザン解析の結果から、線虫には唯一個のリアノジン受容体遺伝子があるものと思われる。3)遺伝子DNAの解析:物理的染色体から予測されるコスミドクローンをイギリスのMRC分子生物学研究所から取り寄せ、遺伝子DNAを3'末端から順次塩基配列を決定し、約16kbの遺伝子構造を明らかにした。エクソン部分から推定したアミノ酸配列と哺乳類のリアノジン受容体のアミノ酸配列とを比較したところ膜貫通領域のみならず足構造部分にも高い相同性が見られた。繰り返し配列やATP結合領域など機能部位の解析を進めている。4)リアノジン受容体の抗体作成:クローン化したcDNAをlad-Z遺伝子の下流に読み枠をそろえてつなぎ、大腸菌内で発現させb-ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を単離精製して抗体を作成中でる。