Ca^<2+>/カルモジュリン依存性キナーゼ活性の可視化試薬の開発と応用

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我々はすでに蛍光CaMKI可視化試薬(AS2)の創製に成功しているが、その安定性、感度、選択性をさらに高めることを目的として本研究を計画した。本年度は次の点について、研究の進捗があった。1)AS2の蛍光強度を高めるためAcrylodaneに代えてDACM(N-(7-Dimethy lamino-4-methyl-coumarinyl)-maleimide)を結合させた試薬(DS2)を合成した。この試薬は確かにAS2より強い蛍光を発したが若干毒性があり、AS2を大きく越える試薬とはならなかった。2)AS2の安定性を高めるためにN-末のLeucineをD-Leucineに置き換えたDLAS2を作った。この試薬は予想通り安定性が増し、細胞内での残存率が飛躍的に高まった。しかし、リン酸化反応がAS2に比べて遅くなっていた。従って、リン酸化の測度を正確に測定することは難しいものと思われるが、長時間の計測には有効と思われる。3)AS2にはCa活性化カルモデュリンとの結合による470nmの蛍光上昇が見られ、これがリン酸化測定の精度をやや鈍らせていた。そこで、Caおよびカルモデュリン存在下でAS2の470nmの蛍光が少ない試薬として、Syntide2の基礎となった基質、グリコーゲンシンターゼのCaMKIIによるリン酸化部位の部分ペプチドを参考として、C-末をLE(Leucine-glutamic acid)に置き換えた試薬にAcrylo daneを結合した試薬、LEAS2を創製したこの試薬についてはCa/カルモデュリンとの反応の際に470nmの蛍光はほとんど生じなかった。この試薬のリン酸化はAS2より遅く、また、リン酸化によって蛍光強度が減少した。4)さらに本年度はCaMKIIの自己リン酸化部位の部分ペプチドを参考として新しい試薬の作製に着手した。