Ca^<2+>/カルモジュリン依存性キナーゼ活性の可視化試薬の開発と応用

Ca^2+/钙调蛋白依赖性激酶活性可视化试剂的开发与应用

• 批准号: 09273249
• 负责人: 工藤 佳久
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09273249/
• 关键词: Ca^<2+>; カルモジュリン依存性キナーゼ; 可視化試薬; リン酸化; カルモジュリン; カルシウム; 蛍光

我々はすでに蛍光CaMKI可視化試薬(AS2)の創製に成功しているが、その安定性、感度、選択性をさらに高めることを目的として本研究を計画した。本年度は次の点について、研究の進捗があった。1)AS2の蛍光強度を高めるためAcrylodaneに代えてDACM(N-(7-Dimethy lamino-4-methyl-coumarinyl)-maleimide)を結合させた試薬(DS2)を合成した。この試薬は確かにAS2より強い蛍光を発したが若干毒性があり、AS2を大きく越える試薬とはならなかった。2)AS2の安定性を高めるためにN-末のLeucineをD-Leucineに置き換えたDLAS2を作った。この試薬は予想通り安定性が増し、細胞内での残存率が飛躍的に高まった。しかし、リン酸化反応がAS2に比べて遅くなっていた。従って、リン酸化の測度を正確に測定することは難しいものと思われるが、長時間の計測には有効と思われる。3)AS2にはCa活性化カルモデュリンとの結合による470nmの蛍光上昇が見られ、これがリン酸化測定の精度をやや鈍らせていた。そこで、Caおよびカルモデュリン存在下でAS2の470nmの蛍光が少ない試薬として、Syntide2の基礎となった基質、グリコーゲンシンターゼのCaMKIIによるリン酸化部位の部分ペプチドを参考として、C-末をLE(Leucine-glutamic acid)に置き換えた試薬にAcrylo daneを結合した試薬、LEAS2を創製したこの試薬についてはCa/カルモデュリンとの反応の際に470nmの蛍光はほとんど生じなかった。この試薬のリン酸化はAS2より遅く、また、リン酸化によって蛍光強度が減少した。4)さらに本年度はCaMKIIの自己リン酸化部位の部分ペプチドを参考として新しい試薬の作製に着手した。

We have successfully developed a new optical CaMKI visualization system (AS2), which is characterized by high stability, sensitivity and selectivity. This year's research and development has been carried out. 1) High luminous intensity of AS2 and DACM(N-(7-Dimethy lamino-4-methyl-coumarinyl)-maleimide) were synthesized. This test is accurate, AS2 is strong, and AS2 is strong. 2) AS2 stability is high, N-terminal Leucine is D-Leucine is replaced by DLAS2. This test shows that the stability of the drug increases and the survival rate in the cell increases significantly. As a result, the acid reaction was reduced to AS2. For example, if you want to measure the acidity, you can do it for a long time. 3) AS2 is a Ca activation complex, and the combination of the complex and the complex increases the luminescence at 470nm. The 470nm fluorescence of AS2 in the presence of Ca ~(2 +), Ca ~(2 +)(Leucine-glutamic acid) is used to create the compound Acrylo dane and LEAS2. The light intensity of this test sample is reduced by AS2. 4) This year, some of CaMKII's own acidified parts were selected for reference and new production methods were started.

项目成果

Tanaka,E., Yamamoto,S., Kudo,Y., Mihara,S.and Higashi,H.: "Mechanisms underlying the rapid depolarization produced by deprivation of oxygen and glucose in rat hippocampal CA1 neurons in vitro" J.Neurophysiol.78. 891-902 (1997)

Tanaka,E.、Yamamoto,S.、Kudo,Y.、Mihara,S. 和 Higashi,H.：“体外大鼠海马 CA1 神经元缺氧和葡萄糖产生快速去极化的机制”J.Neurophysiol。

Uchino,S., Kudo,Y., Watanabe,W., Nakajima-Iijima,S and Mishina,M.: "Inducible expression of N-methyl-D-aspartate(NMDA)receptyor channels from cloned cDNA in CHO cells" Mol.Brain Res. 44. 1-11 (1997)

Uchino,S.、Kudo,Y.、Watanabe,W.、Nakajima-Iijima,S 和 Mishina,M.：“CHO 细胞中克隆 cDNA 的 N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体通道的诱导表达”Mol

工藤 佳久、東 秀好: "生細胞におけるCa2+/CaMIIキナーゼの可視化解析" 細胞工学. 16. 64-69 (1997)

Yoshihisa Kudo、Hideyoshi Higashi：“活细胞中 Ca2+/CaMII 激酶的可视化分析”《细胞工程》16. 64-69 (1997)。

工藤佳久(共著): "バイオイメージング" 曽我部正博、臼倉治郎編集 共立出版, 266 (1998)

Yoshihisa Kudo（合著者）：“Bioimaging”Masahiro Sogabe、Jiro Usukura（编辑）Kyoritsu Shuppan，266（1998）

工藤 佳久、森田 光洋、東 秀好(共著): ""脳機能の解明"-21世紀に向けて-" 赤池紀扶等編集 九州大学出版会, 615 (1998)

工藤义久、森田光宏、东秀吉（合著者）：“大脑功能的阐明”-走向21世纪-，赤池典夫编辑，九州大学出版社，615（1998）