タンパク質複合体形成を利用したカルモジュリン依存性キナーゼの結晶化と構造研究

利用蛋白质复合物形成对钙调蛋白依赖性激酶进行结晶和结构研究

• 批准号: 15770071
• 负责人: 柴田 直樹
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: University of Hyogo (2004)Himeji Institute of Technology (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770071/
• 关键词: カルモジュリン; キナーゼ; 結晶化; X線結晶構造解析法

カルシウムイオン/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼα(CaMKKα)の構造解析を目指して、CaMKKαと抗体(IgG)または抗体フラグメント(Fabフラグメント)及びカルモジュリンとの複合体試料を用いて結晶化を行った。CaMKKαについては完全長のものとFactor XaでフレキシブルなN末端領域を切断した試料とを用いて実験を行った。互いに異なる単クローン抗体を産出する2種類のハイブリドーマを用いてマウス腹水から抗CaMKKα IgGを得た。これを硫安分画とイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。Fabフラグメントは精製されたIgGをパパイン処理することによって得られた。抗体との複合体調製のため、CaMKKα試料をIgGまたはFabと混合し、それを結晶化サンプルとした。結晶化スクリーニングは主に市販のスクリーニングキット10種類を用いて行った。カルモジュリンとの複合体試料とATPアナログとの複合体試料についても同様にスクリーニングを行った。IgGを用いた場合CaMKKα単独では結晶が得られなかった条件でも針状結晶が得られた。しかし、これらはX線回折実験には適さない物であった。また、Fabを用いた場合でも同様の針状結晶が得られた他、沈澱剤として硫酸アンモニウムを用いた場合に板状結晶が得られた。SPring-8での回折実験では回折点を確認することが出来なかった。

The structure analysis of CaMKKα and CaMKK α antibody (IgG) and CaMKKα antibody complex samples were carried out by crystallization. CaMKKαTwo different types of antibodies were produced, namely anti-CaMKK α IgG. The first time I saw him, I saw him. Fab preparation Antibody complex modulation, CaMKKα sample IgG mixed, crystallized Crystallization is the main process of the market. Crystallization is the process of the market. The complex sample of the complex sample In the case of IgG use, CaMKKα is the only crystal that can be obtained under the condition of needle crystal. The X-ray reflection is not appropriate. In the case of Fab, the same needle crystals are obtained, and in the case of precipitation, the same plate crystals are obtained. SPring-8