試験管内構築系を用いた真核生物染色体DNA複製初期反応の解析

真核生物の細胞が娘細胞へ染色体を受け渡していくには各染色体上に複数ある複製開始領域(複製オリジン)から厳密に制御された複製開始が起こることが必要であり、この過程に関与するタンパク質因子は酵母からヒトまで保存されていることがわかってきた。複製オリジンのDNA上には多種類のタンパク質あるいはタンパク質サブ複合体が集合・離散する。本研究では真核生物のモデルとして出芽酵母の粗抽出液を用いて新たに展開している試験管内複合体構築系を中心に用いることにより、複製オリジンに段階的に結合するタンパク質サブ複合体を包括的に分離、解析することを行ってきた。まず、既知の複製前複合体の構成因子であるORC、Cdc6、Tah11、Mcm2-7の複製オリジン上での動態の解析を免疫ブロッティングを用いて行い、結合するタイミングがそれぞれ異なることを見いだし、さらにMcm2-7が安定に結合した後、Cdc6やTah11が離れて行くことを見いだした。また、TAP精製法という新規な手法を用いることによりMcm2-7がTah11と安定な複合体として精製できることを見いだした。この複合体は細胞周期を通して見いだされ、この点が酵母と高等真核生物とで異なっているということがわかった。一方、細胞周期G1-S期に起る、Mcm2-7タンパク質のCdc7/Dbf4キナーゼによるリン酸化過程を試験管内で再現することができた。これらの研究を展開して行くことにより、複製オリジンのDNA上に複製前複合体から複製フォークが形成される過程を詳細に解明する道筋ができてきたと考えている。

真核生物の細胞が娘細胞へ染色体を受け渡していくには各染色体上に複数ある複製開始領域(複製オリジン)から厳密に制御された複製開始が起こることが必要であり、この過程に関与するタンパク質因子は酵母からヒトまで保存されていることがわかってきた。複製オリジンのDNA上には多種類のタンパク質あるいはタンパク質サブ複合体が集合・離散する。本研究では真核生物のモデルとして出芽酵母の粗抽出液を用いて新たに展開している試験管内複合体構築系を中心に用いることにより、複製オリジンに段階的に結合するタンパク質サブ複合体を包括的に分離、解析することを行ってきた。まず、既知の複製前複合体の構成因子であるORC、Cdc6、Tah11、Mcm2-7の複製オリジン上での動態の解析を免疫ブロッティングを用いて行い、結合するタイミングがそれぞれ異なることを見いだし、さらにMcm2-7が安定に結合した後、Cdc6やTah11が離れて行くことを見いだした。また、TAP精製法という新規な手法を用いることによりMcm2-7がTah11と安定な複合体として精製できることを見いだした。この複合体は細胞周期を通して見いだされ、この点が酵母と高等真核生物とで異なっているということがわかった。一方、細胞周期G1-S期に起る、Mcm2-7タンパク質のCdc7/Dbf4キナーゼによるリン酸化過程を試験管内で再現することができた。これらの研究を展開して行くことにより、複製オリジンのDNA上に複製前複合体から複製フォークが形成される過程を詳細に解明する道筋ができてきたと考えている。