ペプチド核酸による二本鎖ＤＮＡ認識の構造学的解析と遺伝子工学応用

肽核酸识别双链DNA的结构分析及基因工程应用

• 批准号: 22KJ1567
• 负责人: 柴田 将成
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1567/
• 关键词: DNA; PNA; ペプチド核酸; インベージョン; 結晶構造解析; ヌクレオソーム

ペプチド核酸（PNA）は「インベージョン」と呼ばれる二本鎖DNAとの特徴的な結合様式が可能であり、生体内での二本鎖DNAの配列選択的な認識技術として応用が期待されている。本申請課題では、これまで詳細な立体構造が解明されていないインベージョン複合体について構造学的な分析に取り組み、二本鎖DNAを制御する基盤技術への展開を目指す。本年度はインベージョン複合体のX線結晶構造解析に取り組んだ。研究開始当初に設計したインベージョン複合体で得た結晶は安定性が低く、結晶化までに時間を要したためサンプルの再設計を行った。二本鎖DNAおよびPNAの鎖長をそれぞれ短縮し、さらにPNA/DNAの2か所の相補領域を同一の塩基配列として簡略化を行うことで、サンプル調製から結晶化スクリーニングまでの工程を迅速化した。また、測定条件において安定な結晶を得ることに成功した。また、インベージョン複合体の部分構造となるPNA/DNA二本鎖のX線結晶構造解析に取り組んだ。多波長異常散乱法での解析のため、チミン塩基と同様の塩基対形成が可能かつ、臭素原子を有するウラシル塩基誘導体を原料としてPNAモノマーを合成した。これを用いた固相合成により、PNAオリゴマーの合成、精製まで完了し、結晶化スクリーニングに取り組んでいる。真核生物の生体内のDNA のモデルとして、ヒストンタンパク質とDNA を人工的に複合化した再構成ヌクレオソームを標的とし、PNAによるインベージョンが可能か検証した。ヒストンタンパク質と二本鎖DNAが相互作用する複数の領域を標的として、蛍光標識PNAを合成した。ゲル電気泳動によって複合体の形成を評価した結果、ヒストンタンパク質と複合化していない二本鎖DNAに対してはインベージョン複合体が形成した一方で、ヌクレオソームに対しては複合体の形成がみられず、全く異なる挙動を確認した。

ペ プ チ ド nucleic acid (PNA) は "イ ン ベ ー ジ ョ ン" と shout ば れ る 2 lock DNA と の な combined with others in type of 徴 が may で あ り, born in vivo で の 2 lock の DNA match column sentaku な understanding technology と し て 応 with が expect さ れ て い る. This application subject で は, こ れ ま で な detailed three-dimensional structure が interpret さ れ て い な い イ ン ベ ー ジ ョ ン complex に つ い て tectonics な analysis に み り group, 2 lock DNA を suppression す る base plate technology へ を mesh refers to す の. Analysis of the <s:1> X-ray crystal structure of the んだ and <s:1> ベ and ジョ ジョ complexes in this year に take the んだ group んだ. Research started at the beginning に design し た イ ン ベ ー ジ ョ ン complex で た crystal は low stability が く, crystallization ま で に time を し た た め サ ン プ ル の redesign を line っ た. 2 lock DNA お よ び PNA の lock long を そ れ ぞ れ shortening し, さ ら に PNA/DNA の 2 か の fill phase field を same の salt base with column と し て briefly the line を う こ と で, サ ン プ ル modulation か ら crystallization ス ク リ ー ニ ン グ ま で の engineering を quickly turn し た. Youdaoplaceholder0, determination conditions にお て て stabilization な crystallization を る る とに とに success た た. Youdaoplaceholder0, <s:1> ベ ジョ ジョ ジョ <s:1> partial structure of the <s:1> complex となる analysis of X-ray crystallization structure of PNA/DNA binary lock <s:1> に take the <s:1> set んだ. Multiwavelength abnormal scattered method で の parsing の た め, チ ミ ン salt base と with others の salt base may form が seaborne か つ, smelly, atomic を す る ウ ラ シ ル salt induced を raw materials base と し て PNA モ ノ マ ー を synthetic し た. こ れ を with い た solid-phase synthesis に よ り, PNA オ リ ゴ マ ー の synthesis, refined ま で finished し, crystallization ス ク リ ー ニ ン グ に group take り ん で い る. Eukaryotes の raw の DNA in vivo の モ デ ル と し て, ヒ ス ト ン タ ン パ ク qualitative と DNA を artificial composite に し た reconstitution ヌ ク レ オ ソ ー ム を mark と し, PNA に よ る イ ン ベ ー ジ ョ ン が may か 検 card し た. ヒ ス ト ン タ ン パ ク qualitative と 2 lock DNA が interaction す る plural の field を mark と し て 蛍 light logo PNA を synthetic し た. ゲ ル electric 気 swimming に よ っ て complex の form を review 価 し た results, ヒ ス ト ン タ ン パ ク mass composite と し て い な い 2 lock DNA に し seaborne て は イ ン ベ ー ジ ョ ン complex が form し た で, ヌ ク レ オ ソ ー ム に し seaborne て は complex の form が み ら れ ず, whole く different な る 挙 dynamic を confirm し た.

项目成果

New Design of Peptide Nucleic Acids Recognizng Double-Stranded DNA

识别双链DNA的肽核酸的新设计

• 发表时间: 2022
• 作者: M. Shibata;Y. Aiba;M. Hibino;O. Shoji
• 通讯作者: O. Shoji

二本鎖DNAとのインベージョン複合体形成におけるparallel配向ペプチド核酸の特性評価

双链 DNA 入侵复合物形成中平行定向肽核酸的表征

• 发表时间: 2023
• 作者: 柴田将成;愛場雄一郎;日比野柾;荘司長三
• 通讯作者: 荘司長三