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ペプチド核酸による二本鎖ＤＮＡ認識の構造学的解析と遺伝子工学応用

肽核酸识别双链DNA的结构分析及基因工程应用

基本信息

批准号：
22KJ1567
负责人：
柴田将成
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1567/
关键词：
DNA PNA ペプチド核酸インベージョン結晶構造解析ヌクレオソーム

项目摘要

ペプチド核酸（PNA）は「インベージョン」と呼ばれる二本鎖DNAとの特徴的な結合様式が可能であり、生体内での二本鎖DNAの配列選択的な認識技術として応用が期待されている。本申請課題では、これまで詳細な立体構造が解明されていないインベージョン複合体について構造学的な分析に取り組み、二本鎖DNAを制御する基盤技術への展開を目指す。本年度はインベージョン複合体のX線結晶構造解析に取り組んだ。研究開始当初に設計したインベージョン複合体で得た結晶は安定性が低く、結晶化までに時間を要したためサンプルの再設計を行った。二本鎖DNAおよびPNAの鎖長をそれぞれ短縮し、さらにPNA/DNAの2か所の相補領域を同一の塩基配列として簡略化を行うことで、サンプル調製から結晶化スクリーニングまでの工程を迅速化した。また、測定条件において安定な結晶を得ることに成功した。また、インベージョン複合体の部分構造となるPNA/DNA二本鎖のX線結晶構造解析に取り組んだ。多波長異常散乱法での解析のため、チミン塩基と同様の塩基対形成が可能かつ、臭素原子を有するウラシル塩基誘導体を原料としてPNAモノマーを合成した。これを用いた固相合成により、PNAオリゴマーの合成、精製まで完了し、結晶化スクリーニングに取り組んでいる。真核生物の生体内のDNA のモデルとして、ヒストンタンパク質とDNA を人工的に複合化した再構成ヌクレオソームを標的とし、PNAによるインベージョンが可能か検証した。ヒストンタンパク質と二本鎖DNAが相互作用する複数の領域を標的として、蛍光標識PNAを合成した。ゲル電気泳動によって複合体の形成を評価した結果、ヒストンタンパク質と複合化していない二本鎖DNAに対してはインベージョン複合体が形成した一方で、ヌクレオソームに対しては複合体の形成がみられず、全く異なる挙動を確認した。

The combination of PNA and its characteristics is possible, and the recognition technology and application of PNA in vivo are expected. The subject of the present application is to provide guidance for the development of a substrate technology for the analysis of structural groups and the control of two-dimensional DNA in detail for the interpretation of three-dimensional structures. This year, X-ray crystal structure analysis of the complex was performed. The study began with the design of the complex, the crystallization of which was stable, and the re-design of the complex. The length of the two DNA chains is shortened, and the complementary domain of the two DNA chains is simplified. The engineering of crystallization is accelerated. The determination conditions were stable and the crystallization was successful. X-ray crystallographic analysis of the partial structure of the PNA/DNA duplex complex. Multi-wavelength anomalous scattering method is used to analyze and synthesize PNA. The synthesis, purification and crystallization of PNA in solid phase synthesis are discussed. DNA in eukaryotes can be artificially complexed to form a complex DNA in vivo. The DNA of the two molecules interacts with each other, and the DNA of the two molecules interacts with each other. The results of the evaluation of the formation of the electrophoresis complex show that the formation of the electrophoresis complex is related to the formation of the electrophoresis complex and the formation of the electrophoresis complex.