貯蔵脂質の生合成を支配するアシルーACPハイドロラ-ゼの遺伝子の構造解析

控制储存脂质生物合成的酰基 ACP 水解酶基因的结构分析

• 批准号: 02261219
• 负责人: 村田 紀夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02261219/
• 关键词: アシル(アシルキャリア蛋白質)ハイドロラ-ゼ; 貯蔵脂質; トリアシルグリセロ-ル

1.研究的目ー高等植物の貯蓄脂質トリアシルグリセロ-ルの生合成の律速段階の一つは、脂肪酸をアシルキャリア蛋白質(ACP)から遊離する反応である。この反応を司る酵素はアシル-ACPハイドロラ-ゼであるが、この酵素は未だ精製されず、またその遺伝子も単離されていない。本研究では、アシルーACPハイドロラ-ゼを精製し、そのcDNAを単離することを目的とした。2.研究成果ー(1)カボチャ子葉より葉緑体を単離し、そのストロ-マ画分を等電点電気泳動に供したところ、アシルーACPハイドロラ-ゼは等電点が4.5,5.3および7.8(それぞれAH1,AH2およびAH3と略す)のイソ型に分離した。(2)アシルーACPハイドロラ-ゼのイソ型の一つ(AH1)をカボチャ葉の抽出液より酸沈澱法、ポリエチレングリコ-ル沈澱法、DEAEーイオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、ACPアフィニティクロマトグラフィおよびMonopー等電点クロマトグラフィにより6,500倍にまで精製した。この活性画分をSDSーPAGEに供したところ、分子量54,000、40,000および33,000のポリペプチドが含まれていた。このうち分子量33,000のポリペプチドが活性と対応することがわかった。この結果とゲルろ過クロマトグラフィの結果から、AH1は分子量6万前後の二量体であると推定された。(3)精製酵素のアミノ酸の部分配列をMatsudairaの方法に従い決定した。(4)カボチャ葉より、フェノ-ル/ドデシル硫酸ナトリウム法によりRNAを調製し、さらにオリゴテックスdT(30)によりpoly(A^+)RNAを精製し、cDNAライブラリ-をファジ-ベクタ-λZAPIIを用いて作製した。

1. Research item ー higher plants の case-dough lipid ト リ ア シ ル グ リ セ ロ - ル の biosynthesis の law speed Duan Jie の a つ は, fatty acid を ア シ ル キ ャ リ ア protein (ACP) か ら free す る anti 応 で あ る. こ の anti 応 を department る enzyme は ア シ ル - ACP ハ イ ド ロ ラ - ゼ で あ る が, こ の enzyme は not だ refined さ れ ず, ま た そ の heritage 伝 son も 単 from さ れ て い な い. This study で は, ア シ ル ー ACP ハ イ ド ロ ラ - ゼ を refined し, そ の cDNA を 単 from す る こ と を purpose と し た. ー 2. Research results (1) カ ボ チ ャ cotyledon よ り chloroplast を 単 し, そ の ス ト ロ - マ painting を isoelectric point electric 気 swimming に for し た と こ ろ, ア シ ル ー ACP ハ イ ド ロ ラ - ゼ は isoelectric point が 4.5, and 5.3 お よ び 7.8 (そ れ ぞ れ AH1, AH2 お よ び AH3 と slightly す) の イ separation type ソ に し た. (2) ア シ ル ー ACP ハ イ ド ロ ラ - ゼ の イ ソ type の a つ (AH1) を カ ボ チ の ャ leaves extract よ り acid precipitates, ポ リ エ チ レ ン グ リ コ - ル precipitates, DEAE ー イ オ ン exchange ク ロ マ ト グ ラ フ ィ, ゲ ル ろ too ク ロ マ ト グ ラ フ ィ, ACP ア フ ィ ニ テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ お よ び Monop ー, etc Electric dot ロ ロ トグラフィによ トグラフィによ トグラフィによ トグラフィによ 6,500 times にまで refining た た. こ の active draw points を ー SDS PAGE に for し た と こ ろ, molecular weight 54000, 40000 お よ び 33000 の ポ リ ペ プ チ ド が containing ま れ て い た. <s:1> うち うち molecular weight 33,000 ポリペプチドが ポリペプチドが activity と against 応する った とがわ とがわ った った. The <s:1> <s:1> results とゲ とゲ ろ ろ over ロ ロ トグラフィ トグラフィ the <s:1> results ら ら and the <s:1> dimer of AH1 とゲ with a molecular weight of around 60,000 であると are presumed to be された. (3) The refined enzyme <s:1> ア ノ ノ is assigned to the acid <s:1> section by the をMatsudaira stage method に従 た determines the <s:1>. (4) カ ボ チ ャ leaf よ り, フ ェ ノ ル / ド デ シ ル sulfate ナ ト リ ウ ム method に よ り RNA を modulation し, さ ら に オ リ ゴ テ ッ ク ス dT (30) に よ り poly real (A ^ +) RNA を refined し, cDNA ラ イ ブ ラ リ - を フ ァ ジ - ベ ク タ - lambda ZAPII を with い て cropping し た.

项目成果

Hiroyuki Imai,: "Purification and characterization of long chain fatty acyl(acylcarrierーprotein) hydrolase of squash cotyledons"

Hiroyuki Imai，：“南瓜子叶长链脂肪酰基（酰基载体蛋白）水解酶的纯化和表征”