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貯蔵脂質の生合成を支配するアシルーACPハイドロラ-ゼの遺伝子の構造解析

控制储存脂质生物合成的酰基 ACP 水解酶基因的结构分析

基本信息

批准号：
02261219
负责人：
村田紀夫
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.研究的目ー高等植物の貯蓄脂質トリアシルグリセロ-ルの生合成の律速段階の一つは、脂肪酸をアシルキャリア蛋白質(ACP)から遊離する反応である。この反応を司る酵素はアシル-ACPハイドロラ-ゼであるが、この酵素は未だ精製されず、またその遺伝子も単離されていない。本研究では、アシルーACPハイドロラ-ゼを精製し、そのcDNAを単離することを目的とした。2.研究成果ー(1)カボチャ子葉より葉緑体を単離し、そのストロ-マ画分を等電点電気泳動に供したところ、アシルーACPハイドロラ-ゼは等電点が4.5,5.3および7.8(それぞれAH1,AH2およびAH3と略す)のイソ型に分離した。(2)アシルーACPハイドロラ-ゼのイソ型の一つ(AH1)をカボチャ葉の抽出液より酸沈澱法、ポリエチレングリコ-ル沈澱法、DEAEーイオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、ACPアフィニティクロマトグラフィおよびMonopー等電点クロマトグラフィにより6,500倍にまで精製した。この活性画分をSDSーPAGEに供したところ、分子量54,000、40,000および33,000のポリペプチドが含まれていた。このうち分子量33,000のポリペプチドが活性と対応することがわかった。この結果とゲルろ過クロマトグラフィの結果から、AH1は分子量6万前後の二量体であると推定された。(3)精製酵素のアミノ酸の部分配列をMatsudairaの方法に従い決定した。(4)カボチャ葉より、フェノ-ル/ドデシル硫酸ナトリウム法によりRNAを調製し、さらにオリゴテックスdT(30)によりpoly(A^+)RNAを精製し、cDNAライブラリ-をファジ-ベクタ-λZAPIIを用いて作製した。

1. The purpose of this study is to investigate the lipid storage, lipid metabolism and lipid metabolism in higher plants. The enzyme is not refined, and the enzyme is not purified. This study aims to improve the quality of the ACP and its cDNA. 2. Results (1) The isoelectric point of chloroplasts was 4.5, 5.3 and 7.8(AH1,AH2 and AH3), respectively. (2)ACP-free extract (AH1) acid precipitation method, POL-free precipitation method, DEAE-free exchange method, ACP-free isoelectric point purification method 6,500 times. SDS PAGE analysis of these active molecules shows that the molecular weights of 54,000, 40,000 and 33,000 are different. This polymer with a molecular weight of 33,000 has great activity and compatibility. The results of this study suggest that AH1 has a molecular weight of 60,000. (3)The partial alignment of purified enzymes and enzymes was determined by Matsudaira method. (4)The RNA modulation method is used to refine poly(A^+)RNA, cDNA amplification, and cDNA amplification.