貯蔵脂質の生合成を支配するアシルーACPハイドロラ-ゼの遺伝子の構造解析

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1.研究的目ー高等植物の貯蓄脂質トリアシルグリセロ-ルの生合成の律速段階の一つは、脂肪酸をアシルキャリア蛋白質(ACP)から遊離する反応である。この反応を司る酵素はアシル-ACPハイドロラ-ゼであるが、この酵素は未だ精製されず、またその遺伝子も単離されていない。本研究では、アシルーACPハイドロラ-ゼを精製し、そのcDNAを単離することを目的とした。2.研究成果ー(1)カボチャ子葉より葉緑体を単離し、そのストロ-マ画分を等電点電気泳動に供したところ、アシルーACPハイドロラ-ゼは等電点が4.5,5.3および7.8(それぞれAH1,AH2およびAH3と略す)のイソ型に分離した。(2)アシルーACPハイドロラ-ゼのイソ型の一つ(AH1)をカボチャ葉の抽出液より酸沈澱法、ポリエチレングリコ-ル沈澱法、DEAEーイオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、ACPアフィニティクロマトグラフィおよびMonopー等電点クロマトグラフィにより6,500倍にまで精製した。この活性画分をSDSーPAGEに供したところ、分子量54,000、40,000および33,000のポリペプチドが含まれていた。このうち分子量33,000のポリペプチドが活性と対応することがわかった。この結果とゲルろ過クロマトグラフィの結果から、AH1は分子量6万前後の二量体であると推定された。(3)精製酵素のアミノ酸の部分配列をMatsudairaの方法に従い決定した。(4)カボチャ葉より、フェノ-ル/ドデシル硫酸ナトリウム法によりRNAを調製し、さらにオリゴテックスdT(30)によりpoly(A^+)RNAを精製し、cDNAライブラリ-をファジ-ベクタ-λZAPIIを用いて作製した。