カルシウムイオンによる筋収縮制御機構のクライオ電子顕微鏡法による構造研究

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昨年度の研究により、溶液中での結晶化条件を参考にして、脂質単分子膜への吸着法による結晶化を行ない、ミクロスケ-ルのテフロンウェルを用いてアクチン二次元結晶の作製に成功した。(1)この二次元準結晶(パラクリスタル)は成長は速いが、幅は溶液中で作製した場合の最良のものと同程度である。(2)脂質単分子膜への吸着量が少なく、電子顕微鏡下で探すのに労力を要する。本年度は(1)(2)を改善するために次のような手法を試みた。問題点(1)を改善するため、短いフィラメントを核として結晶成長をスタ-トさせ、脂質単分子膜に吸着された状態でフィラメントをさらに重合して伸張させる方法を試みた。問題点(2)を改善するため、Mg濃度を下げた。Mg濃度が低い方がアクチン・フィラメントの表面負電荷に対する遮蔽効果が少なく、脂質単分子膜への吸着量は増加する。Mg濃度を下げることは、幅の広いパラクリスタルを成長させるためにも有効であると考えられる。しかしMg濃度が高い方がフィラメントが真直ぐになり、フィラメント間の結合も強くなる。具体的にはF‐アクチン試料を2分間超音波で破砕し、フィラメント長を短くした後、脂質単分子膜の下の緩衝液に注入する。短フィラメントが脂質単分子膜に吸着された後、G‐アクチン(アクチン・モノマ-)試料を緩衝液中に注入し、脂質単分子膜に吸着されたフィラメントを伸張させる。電子顕微鏡で見ると多数のフィラメントが側面会合しているのが観察され、この手法の有効性が証明された。フィラメントによる単分子膜の破覆率も大幅に向上した。だが、フィラメントの直線性が低下し、大きくうねっているのが観察された。この試料を構造解析するためには、画像解析の段階でフィラメントの屈曲を補正する必要がある。