ホスホリパ-ゼA_2におけるCa^<2+>結合の動的構造と機能発現メカニズムの解明

磷脂酶A_2中Ca^2+结合的动态结构和功能机制的阐明

• 批准号: 03241104
• 负责人: 林 恭三
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Gifu Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03241104/
• 关键词: ホスホリパ-ゼA_2; Ca^<2+>依存性複合体; スフィンゴミエリン; 結合定数; 金属イオン; ランタニドイオン; 触媒中心; 触媒効率

われわれはすでに酵素反応速度論のパラメ-タ-のCa^<2+>依存性から酵素と基質のミカエリス複合体にはCa^<2+>依存性複合体と非依存性複合体が存在しそれらの分率がグル-プIとIIのホスホリパ-ゼ(PL)A_2で異なる可能性を見出していた。本研究はこれらの複合体の構造とCa^<2+>の役割を明らかにするためグリセロリン脂質の2位の脂肪酸エステル結合をアミド結合に変換したいくつかのスフィンゴミエリン同族体を合成し酵素活性の阻害および直接結合におよぼすCa^<2+>の影響を明らかにすることを目的とした。その結果、(1)PLA_2の触媒作用にはCa^<2+>酵素に対する結合が必須であることがわかった。またグル-プIの酵素に対する基質の結合はCa^<2+>の結合とは独立であり、一方グル-プIIの酵素に対する基質の結合定数はCa^<2+>がない場合グル-プIの酵素の値より10倍程度小さいがCa^<2+>の結合により10倍以上増大することがわかった。(2)親水基としてホスホグリコ-ルおよびホスホコリン基をもつスフィンゴミエリン同族体はともにジヘキサデカノイルレシチンを基質とする酵素反応を拮抗的に阻害した。(3)Ca^<2+>と全く同様にランタニドイオンを含む種々の金属イオンがPLA_2およびこれらの基質複合体と結合し、Ca^<2+>の場合の最大25%以下の酵素活性を示すことがわかった。また酵素と金属イオン複合体に対する基質の結合定数はイオンの種類にほとんど依存しないが触媒中心活性の最大値を示すには適当なイオン半径が必要であることがわかった。これは酵素金属イオン基質複合体の構造はある程度曖昧なものであるが以後の触媒反応が有効に進むためには遷移状態中間体の構造が極めて厳密でなければならないことを示唆している。(4)基質がミセルを形成すると酵素と基質との結合力1/kmおよび触媒中心活性Kcatがともに著しく増大することや基質のミセル形成に伴うグル-プIIの酵素の触媒効率の増大がグル-プIの酵素の触媒効率の増大の2倍以上であることがわかった。これらの新しい知見を得た。

わ れ わ れ は す で に enzyme reverse 応 speed theory の パ ラ メ タ - の Ca ^ 2 + < > dependency か ら enzyme と matrix の ミ カ エ リ ス complex に は Ca ^ 2 + < > dependence complex と not dependence exist complex が し そ れ ら の fraction が グ ル - プ I と II の ホ ス ホ リ パ - ゼ (PL) A_2 で different な る を likely see a し て い た . This study は こ れ ら の complex の tectonic と Ca ^ 2 + < > cut を の service Ming ら か に す る た め グ リ セ ロ リ ン lipid の two の fatty acids エ ス テ ル combining を ア ミ ド combining に variations in し た い く つ か の ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ン homolog し を synthesis enzyme activity の resistance against お よ び directly combined に お よ ぼ す Ca ^ 2 + > < の influence を Ming ら か Youdaoplaceholder0 た とを purpose と た た. Youdaoplaceholder0 そ result, (1)PLA_2 catalyst action に に Ca^<2+> enzyme に for する binding が must である である とがわ った った った った った った. ま た グ ル - プ I の enzyme に す seaborne の る matrix combining は Ca ^ 2 + < > の combining と は independent で あ り, one party グ ル - プ の II enzymes に す seaborne の る matrix combined with destiny は Ca ^ 2 + < > が な い occasions グ ル - プ I の enzyme の numerical よ り degree of 10 times the small さ い が Ca ^ 2 + > < の combining に よ り over 10 times raised large す る こ と が わ Youdaoplaceholder0 った. (2) the hydrophilic group と し て ホ ス ホ グ リ コ - ル お よ び ホ ス ホ コ リ ン base を も つ ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ン homolog は と も に ジ ヘ キ サ デ カ ノ イ ル レ シ チ ン を matrix と す る enzyme reverse 応 を antagonism against the に resistance against し た. Ca (3) ^ 2 + > < と full く with others に ラ ン タ ニ ド イ オ ン を む 々 species. の metal イ オ ン が PLA_2 お よ び こ れ ら の matrix composite と し, Ca ^ 2 + < > の occasions の less than 25% of the largest を の enzyme activity and shown す こ と が わ か っ た. ま た enzyme と metal イ オ ン complex に す seaborne の る matrix combined with destiny は イ オ ン の kinds に ほ と ん ど dependent し な い が catalytic activity center の nt biggest を shown す に は appropriate な イ オ ン radius が necessary で あ る こ と が わ か っ た. こ れ は enzyme metal イ オ ン matrix composite の tectonic は あ る degree of ambiguity な も の で あ る が の catalyst after the 応 が have sharper に into む た め に は の tectonic migration state intermediates が extremely め て 厳 dense で な け れ ば な ら な い こ と を in stopping し て い る. (4) matrix が ミ セ ル を form す る と と enzyme substrate と の binding force 1 / km お よ び catalytic activity center Kcat が と も に the し く raised large す る こ と や matrix の ミ セ ル form に with う グ ル - プ II の の enzyme catalytic の raised large working rate が グ ル - プ I の の enzyme catalytic の raised large working rate の 2 times more than で あ る こ と が わ か っ た. Youdaoplaceholder6 れら れら れら the new epoch epoch を the た.

项目成果

Shinobu Fujii,Toshihiko Inoue,Seiji Inoue,Kiyoshi Ikeda: "Kinetics of the Hydrolvsis of Monodispersed Dihexanovlphosphatidylcholine Catalyzed by Bovine Pancreatic Phospholipase A_2:Roles of Ca^<2+>Binding and Ionizations of Amino Acid Residues in the Acti

Shinobu Fujii，Toshihiko Inoue，Seiji Inoue，Kiyoshi Ikeda：“牛胰磷脂酶 A_2 催化的单分散二己酚磷脂酰胆碱水解动力学：Ca^<2>在活性物质中氨基酸残基的结合和电离的作用

Hiroko Nishimura,Seiji Inoue,Kiyoshi Ikeda,Keizo Teshima,Yuji Samejima,Tamotsu OmoriーSatoh,Kyozo Hayashi: "Kinetics of the Hydrolysis of Micellar Substrates Catalyzed by Snake Venom Phospholipase A_2" Journal of Biochemistry. 111. 210-218 (1992)

Hiroko Nishimura、Seiji Inoue、Kiyoshi Ikeda、Keizo Teshima、Yuji Samejima、Tamotsu Omori-Satoh、Kyozo Hayashi：“蛇毒磷脂酶 A_2 催化的胶束底物水解动力学”《生物化学杂志》111. 210-218 (1992)。