光合成細菌の生産するモリブデン酵素の活性中心構造と機能

1.DMSO reductaseの特性とMo‐cofactorの性質について精製したDMSO reductaseを熱処理すると蛍光物質を遊離し、蛍光スペクトルより既知のMo酵素のプテリン化合物と類似のプテリン化合物の存在が示された。さらに本酵素の熱変性抽出液を用いて、Neurospora crassa nit‐1 mutantの抽出液中のnitrate reductase活性が再構成されることから、両酵素のMo‐cofactorは共通の構造的特徴を持つことがわかった。更にDMSO reductaseを直接 ^<31>P‐NMRで観測し、ピロリン酸結合の存在を確認した。既知のプテリンはモノエステルであることから、最近Johnsonらによって同定された新規プテリン化合物pterin guanine dinucleotideと同一であることがわかった。2.部分加水分解による活性の変化本酵素をtrypsinまたはStaphylococcal protease(V8)で部分加水分解すると、活性が2倍以上上昇するという興味深い現象が観測された。プロテア-ゼ処理したものをNative‐PAGEにかけると、分子量は本来の酵素とほとんど変わらなかったが、SDS‐PAGEではいずれのプロテア-ゼ処理の場合も分子量40,000と42,000程度の2つのフラグメントとして観測された。このことはプロテア-ゼ処理により、酵素の構造の一部が切断を受けるが、立体構造は保持されており、より基質と相互作用しやすい構造になったことが示唆された。そこでtrypsin処理と2‐mercaptoethanol処理を組合せたSDS‐PAGEをおこない、この構造保持にはジスルフィド結合の関与することを明らかにした。プロテア-ゼ処理で得られた各フラグメントはHPLCで精製し、N末端を含む100残基以上のアミノ酸配列を決定した。その結果trypsinとV8 proteaseの切断部位はわずか5残基しか離れていなかった。3.酵素遺伝子のクロ-ニング前記アミノ酸配列を利用してDNAプロ-ブを数種作成し、酵素遺伝子のクロ-ニングを続行中である。

1.DMSO reductaseの特性とMo‐cofactorの性質について精製したDMSO reductaseを熱処理すると蛍光物質を遊離し、蛍光スペクトルより既知のMo酵素のプテリン化合物と類似のプテリン化合物の存在が示された。さらに本酵素の熱変性抽出液を用いて、Neurospora crassa nit‐1 mutantの抽出液中のnitrate reductase活性が再構成されることから、両酵素のMo‐cofactorは共通の構造的特徴を持つことがわかった。更にDMSO reductaseを直接 ^<31>P‐NMRで観測し、ピロリン酸結合の存在を確認した。既知のプテリンはモノエステルであることから、最近Johnsonらによって同定された新規プテリン化合物pterin guanine dinucleotideと同一であることがわかった。2.部分加水分解による活性の変化本酵素をtrypsinまたはStaphylococcal protease(V8)で部分加水分解すると、活性が2倍以上上昇するという興味深い現象が観測された。プロテア-ゼ処理したものをNative‐PAGEにかけると、分子量は本来の酵素とほとんど変わらなかったが、SDS‐PAGEではいずれのプロテア-ゼ処理の場合も分子量40,000と42,000程度の2つのフラグメントとして観測された。このことはプロテア-ゼ処理により、酵素の構造の一部が切断を受けるが、立体構造は保持されており、より基質と相互作用しやすい構造になったことが示唆された。そこでtrypsin処理と2‐mercaptoethanol処理を組合せたSDS‐PAGEをおこない、この構造保持にはジスルフィド結合の関与することを明らかにした。プロテア-ゼ処理で得られた各フラグメントはHPLCで精製し、N末端を含む100残基以上のアミノ酸配列を決定した。その結果trypsinとV8 proteaseの切断部位はわずか5残基しか離れていなかった。3.酵素遺伝子のクロ-ニング前記アミノ酸配列を利用してDNAプロ-ブを数種作成し、酵素遺伝子のクロ-ニングを続行中である。