グループII・イントロンの機能構造の研究

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発芽酵母のミトコンドリアのoxi3遺伝子内のイントロンは、これまでに発見されているグループIIイントロンの中で最も自己触媒活性が高いので、これを用いて研究をおこなった。グループIIイントロンは、2次構造上、ドメインIからドメインVIまでの6つのステムループ構造を持っている。グループIIイントロンのスプライシングの第1段階においては、ドメインVI内のアデノシン2′-OH基が5′スプライス部位を求核攻撃して投げ縄状の構造を形成する経路と、水酸イオンが攻撃して加水分解する、投げ縄状構造を経由しない反応経路の2種類が存在する。最近、5′エクソンとドメインIだけから成るmRNA前駆体に、別途合成したドメインVを加えると、効率は低いが5′スプライス部位での加水分解が起こることが報告された。この事実はドメインIとドメインVだけがあれば、これらが5′スプライス部位と相互作用してスプライシングの第1段階を起こしうることを示している。そこで、5′加水分解反応を詳細に解析するために、単純な系の開発をおこなった。具体的には、まず、T7プロモーター、5′エクソン、およびドメインIの下流に、さらにドメインVをつないだプラスミドを作成し、その転写物の5′スプライス部位での加水分解活性を、さまざまな条件で検討した。その結果、構築したプラスミドの転写物は、0.5M以上のMg2+イオンと1.5M以上のKC1の存在下で、5′スプライス部位での自己切断反応を起こすことがわかった。最適の条件下では、30分の反応により、もとのRNAの約10%が自己触媒的に切断された。構築したプラスミドではドメインVをコードるす領域の両端に制限酵素切断部位を入れてあるので、この領域をまざまな突然変異を持つドメインV様配列と置換することができる。これを利用して、現在、加水分解反応におけるドメインVの必須領域の解明を試みている。