グループII・イントロンの機能構造の研究

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グループIIイントロンは、切り出されたイントロンが投げ縄状構造をとることやイントロン内にU2/U6RNAと類似の構造を持つことから、進化上、高等真核生物のスプライシングに関与するスプライソゾームの原型であると考えられている。グループIIイントロンは、二次構造上、ドメインIからドメインVIまでの6つのドメインを持っているが、これらのうちで特に保存性が高いのは、ドメインI、ドメインVおよびドメインVIである。種々の欠失実験の結果から、グループIIイントロン内の6つのドメインのうち、ドメインIとドメインVが、このイントロンの基本的な触媒活性を担っているものと考えられている。そこで、このイントロンの触媒作用を詳細に解析するための単純な系を確立するために、5'エキソンとドメインIを含む断片の下流にドメインVをつないだプラスミドを作成した。その際、ドメインVをコードする領域の両端に制限酵素切断部位を入れて、ドメインVの部分を任意の合成DNAと置換できるようにデザインした。このプラスミドから転写されたRNAは、ドメインIとドメインVしか持たないにもかかわらず、高濃度のMg^<2+>とK^+の存在下では、反応率は低いものの、5'スプライス部位での切断反応が起こることを確認した。この系ではドメインVをコードする領域の両端に制限酵素切断部位を入れて、ドメインVの部分を任意の合成DNAと置換できるようにデザインしてある。それを利用してドメインVの領域をランダムなヌクレオチド(4種類のヌクレオチドの混合物)に置換し、5'スプライス部位での切断反応の活性を持つ分子種を選択的に分離することによって、活性に必須なドメインV内の部位を同定することを試みた。