形質転換植物を用いた光合成組織における窒素酸化物代謝応答の分子機構の解析

1.ホウレンソウNiR cDNAを有するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の作成とそのNO_2同化能力の測定:ビアラフォス耐性株11系統、ハイグロマイシン耐性株24系統を得た。ビアラフォス耐性株の再分化当代3系統でのサザンハイブリ分析の結果、導入したNiR遺伝子が認められた。しかし、うち2系統の自殖後代6個体を用いた上記の解析では、いずれの個体でもNiR遺伝子は確認されなかった。ハイグロマイシン耐性株では1系統のR_2世代3個体においてサザンハイブリ分析によりNiR遺伝子の存在が確認された。この系統を用いてNO_2暴露により窒素同可能の測定したところNO_2の同化能は野生株の1〜1.2倍であった。また、他の22系統の耐性株ではPCRによりNiR遺伝子の導入が確認された。2.シロイヌナズナNiR cDNAのクローニング:暴露後30分の植物体からRNAを抽出し、cDNAライブラリーを得た。スクリーニングによりNiRの全長を含む1クローンガ得られた。この断片をアンチセンスとしてCaMV35SCプロモーターの制御下においたプラスミドを構築し、これをパーティクルガン法により遺伝子導入を行ない、シロイヌナズナでの形質転換体を得る実験を行っている。3.シロイヌナズナのNO_2暴露に対する遺伝子発現応答の分子生理学的解析:シロイヌナズナで得られているNR,NiR遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った結果、両遺伝子ともNO_2暴露後、30分〜1時間で転写量は暴露前より増加し、2時間目以降転写量は低下した。NO_2暴露においてNR,NiR遺伝子の発現誘導が起こることからNO_2が少なくとも一部は硝酸として取り込まれていることが確認された。また、暴露後短時間(10分)で誘導される遺伝子のクローニングをサブトラクション法を用いてクローン化を行い、108クローンを得た。2次スクリーンニングで22クローンに絞りこれらのノザン解析を行っている。

1.ホウレンソウNiR cDNAを有するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の作成とそのNO_2同化能力の測定:ビアラフォス耐性株11系統、ハイグロマイシン耐性株24系統を得た。ビアラフォス耐性株の再分化当代3系統でのサザンハイブリ分析の結果、導入したNiR遺伝子が認められた。しかし、うち2系統の自殖後代6個体を用いた上記の解析では、いずれの個体でもNiR遺伝子は確認されなかった。ハイグロマイシン耐性株では1系統のR_2世代3個体においてサザンハイブリ分析によりNiR遺伝子の存在が確認された。この系統を用いてNO_2暴露により窒素同可能の測定したところNO_2の同化能は野生株の1〜1.2倍であった。また、他の22系統の耐性株ではPCRによりNiR遺伝子の導入が確認された。2.シロイヌナズナNiR cDNAのクローニング:暴露後30分の植物体からRNAを抽出し、cDNAライブラリーを得た。スクリーニングによりNiRの全長を含む1クローンガ得られた。この断片をアンチセンスとしてCaMV35SCプロモーターの制御下においたプラスミドを構築し、これをパーティクルガン法により遺伝子導入を行ない、シロイヌナズナでの形質転換体を得る実験を行っている。3.シロイヌナズナのNO_2暴露に対する遺伝子発現応答の分子生理学的解析:シロイヌナズナで得られているNR,NiR遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った結果、両遺伝子ともNO_2暴露後、30分〜1時間で転写量は暴露前より増加し、2時間目以降転写量は低下した。NO_2暴露においてNR,NiR遺伝子の発現誘導が起こることからNO_2が少なくとも一部は硝酸として取り込まれていることが確認された。また、暴露後短時間(10分)で誘導される遺伝子のクローニングをサブトラクション法を用いてクローン化を行い、108クローンを得た。2次スクリーンニングで22クローンに絞りこれらのノザン解析を行っている。