オーキシン非要求性変異株(タバコ)より得たAX1159遺伝子の解析

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本年度は,ダイズ,完全長AxicDNA単離と得られた遺伝子断片がAX1159遺伝子と同じ活性を示すかどうかを明らかにすること、及びタバコ中でのAxi遺伝子の発現様式をオーキシン処理や他のストレスを与えた状態で調べた。1.RACE(rapid amplification of cDNA ends)法によりダイズの全長AxicDNAを合成.単離することに成功した。ダイズより得られたAxicDNAは,2073bpであり,タバコAxi遺伝子の5'側が抜けていた。タバコAxi遺伝子とのアミノ酸レベルのホモロジーは両端を除いた489アミノ酸残基において66.9%であった。遺伝子中央付近に存在する浸水性親水性部分は非常によく保存されていた。c末端付近(ホモロジーはない)には、酸性アミノ酸が多くみられ、両遺伝子とも酸性領域を形成していた。2.ダイズAXI遺伝子は,タバコプロトプラストにオーキシン非要求性を付与するか。昨年度は、得られた5'が完全ではないダイズAxi cDNAを発現ベクターであるpRT101(プロモーターはCaMV35SRNAプロモーター)に挿入し,これをタバコ(SR1)の葉肉プロトプラストにPEG法により導入し,3日間暗所で培養した後,プロトプラスの分裂状況を観察した。3回行ったの実験において,プロトプラストは,オーキシン非要求性を示すことを報告した。現在得られた完全長ダイスAxicDNAが同様の活性を示すかどうかを検討中であるが,同様の結果まだ得られていない。3.タバコAxi遺伝子の発現様式Axi遺伝子の発現量は非常に少なく、通常のノーザン解析は容易ではなかった。そこで、RT-PCRによりタバコにおけるAxi遺伝子発現の解析を試みた。野性型タバコの葉においては、Axi遺伝子の発現量は極めて少ない。しかしながら、葉の表面に傷をつけると30分で発現が最高になり、以後発現量は減少し、一時間後には、通常のレベルに戻る。発現の増加の割合は、10倍以上である。オーキシンとしてNAAを10-5M与えて一日後、Axi遺伝子の発現は増加した。同様の実験をサイトカイニンについて行ったが発現の増加は見られなかった。