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遺伝子工学的手法による時間分割ラウエ法に適したリボヌクレアーゼの開発

利用基因工程技术开发适用于时间分辨劳厄法的核糖核酸酶

基本信息

批准号：
08214214
负责人：
入江昌親
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Hoshi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08214214/
关键词：
リボヌクレアーゼ RNase 遺伝子工学 X線結晶解析改変体活性中心

项目摘要

1.ラウエ法に適した反応速度を有する酵素として平成7年度に選定した、Rhizopus niveus のRnase Rhの改変体酵素中つぎのものを作成した。His109Fは RNAに対する活性は1%程度にも低下しているが、環状燐酸エステルを分解する(この速度はRNase RhがDinucldosidephosphateを分解する速度が数万であるのに数十程度である)。Glu105Q,lys108Lは基質に対する結合性は有しているが活性化能が数%に減少している。これらの酵素の量産につとめ結晶化を行いつつある。2.RNase Aの触媒能を損なわず酵素活性を減速した分子種を作成するため、Asp121N,G1n11E改変体の作成を試みた。まず上記のRNase Rhに用いた酵母の発現系を試したが成功せず、プレプロ配列などの改変も成功しなかったので大腸菌の発現系を用いることとした。RNase AのcDNA中の糖鎖結合部位をブロックしたもののN-末端、C-末端にBamHI,Sa1I部位を導入し、glutathione S-trasferaseの発現ベクターpGEX4Tに導入し、大腸菌にトランスフォーメーションしglutathione S-transferaseとのフュージョンタンパク質として菌体内に発現していることを確かめた。この後菌体抽出液よりアフィニィティークロマトグラフィーにより部分精製後、トロンビン消化を行い還元型Rnase Aを得た。これを再酸化してRnase Aを得ているが現在この系の収量の改善を行い、また改変体酵素の発現を行いつつある。

1. The reaction speed of Rhizopus niveus was selected in 2008, and the Rhizopus niveus was selected in 2008. The activity of His109F RNA is reduced to 1%, and the decomposition of cyclic phenolic acid is RNase (the speed of His109F is low) RhがDinucldosidephosphateをdecomposition speedがtens of thousandsであるのにtens of degreesである). The binding properties of Glu105Q and lys108L to the matrix have been reduced by several%, and the activation energy has been reduced by several%. The mass production of これらのenzyme and the crystallization of いつつある. 2. The catalytic activity of RNase A can damage the enzyme activity and slow down the enzyme activity. It can be tested by using molecular species, Asp121N, and G1n11E.まず上记のRNase Rh has successfully tested the system using yeast yeast, and successfully used it, and the combination of プレプロ and などThe success of the change is the success of the coliform bacteria. RNase A's sugar lock binding site in cDNA is the N-terminal and C-terminal BamHI, and the SalI site is introduced and glutathione S-trasferase is introduced into pGEX4T, coliform glutathione S-transferase is a sterile substance in the body of the bacteria.この hind bacterial cell extract liquid よりアフィニィティークロマトグラフィーにより partially purified, トロンビン digestion を line い reduction type RNase Aを得た.これをRe-acidificationしてRnase Aを得ているがNowこの systemの yieldの Improvementを行い、またChange the body enzymeの発行を行いつつある.