遺伝子工学的手法による時間分割ラウエ法に適したリボヌクレアーゼの開発

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1.ラウエ法に適した反応速度を有する酵素として平成7年度に選定した、Rhizopus niveus のRnase Rhの改変体酵素中つぎのものを作成した。His109Fは RNAに対する活性は1%程度にも低下しているが、環状燐酸エステルを分解する(この速度はRNase RhがDinucldosidephosphateを分解する速度が数万であるのに数十程度である)。Glu105Q,lys108Lは基質に対する結合性は有しているが活性化能が数%に減少している。これらの酵素の量産につとめ結晶化を行いつつある。2.RNase Aの触媒能を損なわず酵素活性を減速した分子種を作成するため、Asp121N,G1n11E改変体の作成を試みた。まず上記のRNase Rhに用いた酵母の発現系を試したが成功せず、プレプロ配列などの改変も成功しなかったので大腸菌の発現系を用いることとした。RNase AのcDNA中の糖鎖結合部位をブロックしたもののN-末端、C-末端にBamHI,Sa1I部位を導入し、glutathione S-trasferaseの発現ベクターpGEX4Tに導入し、大腸菌にトランスフォーメーションしglutathione S-transferaseとのフュージョンタンパク質として菌体内に発現していることを確かめた。この後菌体抽出液よりアフィニィティークロマトグラフィーにより部分精製後、トロンビン消化を行い還元型Rnase Aを得た。これを再酸化してRnase Aを得ているが現在この系の収量の改善を行い、また改変体酵素の発現を行いつつある。