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植物由来のリボヌクレアーゼのタンパク質工学的研究

植物源核糖核酸酶的蛋白质工程研究

基本信息

批准号：
08672538
负责人：
入江昌親
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hoshi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672538/
关键词：
リボヌクレアーゼ RNase 遺伝子工学 X線結晶解析改変体活性中心

项目摘要

植物由来のRNaseは真菌由来の塩基非特異的RNaseと構造が類似しているがその三次元構造にかなりの相違があることが知られておりこの相違を明らかにし、酵素化学的性質を知ることは植物の生理的研究のために役立つと考えられる。しかし、このRNaseは収量が悪く研究が停滞している。既に真菌(Rhizopus niveus)由来のRNase Rhの酵母での発現に使用して成功を収めているシャトルベクターpYE2211のglyceroaldehyde 3-phosphate dehydrogenaseプロモタ-の下流にトマト培養細胞より得られたRNaseのcDNAを挿入し酵母細胞より分泌されるRNase Leを大量に発現させることを試みた。この方法により約10mg/liter程度のRNase LEを得ることが出来た。この系は必ずしも完全なものではなくRNase LE N44D等の改変体では0.5 mg/literと分泌量が低下する場合もあるがいくつかの改変体の作成に成功した。この系を利用して次の実験を行った。1.X線結晶解析による三次元構造の解明。結晶化に成功し現在構造解析をおこないつつある。2.トマトRNase中にあるヒスチジン残基のPhe改変体を作成し、His39,His92,His97が活性に直接関与すること、His109,His134は活性中心には存在しないが、この改変はやや活性の減少を起こすことが明らかとなった。3.真菌の酵素の塩基認識部位と相同の位置にあるAsn44をAspに改変することによりトマトRNase Leの塩基特異性はグアニル酸優先性からよりアデニル酸優先的になる。この現象は真菌酵素の塩基認識部位Asp51をAsnに変えたことによる特異性の変化の逆であり、トマト、真菌のRNaseの塩基認識機構は基本的に同一と考えられる。この研究により今後のトマトRNase Le等の植物RNaseの作用機構の解明に突破口を開いたと考えている。

RNase originating from plants, RNase originating from fungi, non-specific RNase structure, similar structure, three-dimensional structure, conflicting structureことが知られておりこの contradictory を明らかにし, the chemical properties of enzymes を知ることは Plant のphysiology research のために佪立つと考えられる.しかし, このRNase は yield が悪く research が stagnation している. The origin of the fungus (Rhizopus niveus) is RNase Rh and yeast is used successfully and it is successfully harvested. dehydrogenase プロモタ-のDownstream にトマトcultured cells よりget られたRNase のcDNAをinsert しyeast cells よりsecret RNase Leをa large number of に発appearsさせることをtrialみた. The method is to use RNase LE at about 10mg/liter level.この式は必ずしも全なものではなくRNase LE N44D and other modifications では0.5 mg/liter and the secretion amount are low and the situation is low and the situation is successful.この system を utilize して times の実験を行った. 1.X-ray crystallographic analysis and the elucidation of the three-dimensional structure. The crystallization was successful and now the structural analysis is done. 2. The activity of the Phe-modified residues in Tomat RNase, His39, His92, and His97 are directly related toすること, His109, His134 have active centers that exist and are active. 3.Fungal enzyme の塩base recognition part と Same position にあるAsn44をAspに change 変することによりトマトRNase Le の塩 group specificity はグアニル acid priority からよりアデニル acid priority になる.このphenomenonはFungal enzymeの塩base recognition partAsp51をAsnに変えたことによるSpecificityの変Chemical inversion, トマト, fungus RNase, basic recognition mechanism, basic に Same test, えられる. The future research on RNase Le et al. has revealed the mechanism of action of plant RNase and opened a breakthrough in the research.