植物由来のリボヌクレアーゼのタンパク質工学的研究

植物由来のRNaseは真菌由来の塩基非特異的RNaseと構造が類似しているがその三次元構造にかなりの相違があることが知られておりこの相違を明らかにし、酵素化学的性質を知ることは植物の生理的研究のために役立つと考えられる。しかし、このRNaseは収量が悪く研究が停滞している。既に真菌(Rhizopus niveus)由来のRNase Rhの酵母での発現に使用して成功を収めているシャトルベクターpYE2211のglyceroaldehyde 3-phosphate dehydrogenaseプロモタ-の下流にトマト培養細胞より得られたRNaseのcDNAを挿入し酵母細胞より分泌されるRNase Leを大量に発現させることを試みた。この方法により約10mg/liter程度のRNase LEを得ることが出来た。この系は必ずしも完全なものではなくRNase LE N44D等の改変体では0.5 mg/literと分泌量が低下する場合もあるがいくつかの改変体の作成に成功した。この系を利用して次の実験を行った。1.X線結晶解析による三次元構造の解明。結晶化に成功し現在構造解析をおこないつつある。2.トマトRNase中にあるヒスチジン残基のPhe改変体を作成し、His39,His92,His97が活性に直接関与すること、His109,His134は活性中心には存在しないが、この改変はやや活性の減少を起こすことが明らかとなった。3.真菌の酵素の塩基認識部位と相同の位置にあるAsn44をAspに改変することによりトマトRNase Leの塩基特異性はグアニル酸優先性からよりアデニル酸優先的になる。この現象は真菌酵素の塩基認識部位Asp51をAsnに変えたことによる特異性の変化の逆であり、トマト、真菌のRNaseの塩基認識機構は基本的に同一と考えられる。この研究により今後のトマトRNase Le等の植物RNaseの作用機構の解明に突破口を開いたと考えている。

植物由来のRNaseは真菌由来の塩基非特異的RNaseと構造が類似しているがその三次元構造にかなりの相違があることが知られておりこの相違を明らかにし、酵素化学的性質を知ることは植物の生理的研究のために役立つと考えられる。しかし、このRNaseは収量が悪く研究が停滞している。既に真菌(Rhizopus niveus)由来のRNase Rhの酵母での発現に使用して成功を収めているシャトルベクターpYE2211のglyceroaldehyde 3-phosphate dehydrogenaseプロモタ-の下流にトマト培養細胞より得られたRNaseのcDNAを挿入し酵母細胞より分泌されるRNase Leを大量に発現させることを試みた。この方法により約10mg/liter程度のRNase LEを得ることが出来た。この系は必ずしも完全なものではなくRNase LE N44D等の改変体では0.5 mg/literと分泌量が低下する場合もあるがいくつかの改変体の作成に成功した。この系を利用して次の実験を行った。1.X線結晶解析による三次元構造の解明。結晶化に成功し現在構造解析をおこないつつある。2.トマトRNase中にあるヒスチジン残基のPhe改変体を作成し、His39,His92,His97が活性に直接関与すること、His109,His134は活性中心には存在しないが、この改変はやや活性の減少を起こすことが明らかとなった。3.真菌の酵素の塩基認識部位と相同の位置にあるAsn44をAspに改変することによりトマトRNase Leの塩基特異性はグアニル酸優先性からよりアデニル酸優先的になる。この現象は真菌酵素の塩基認識部位Asp51をAsnに変えたことによる特異性の変化の逆であり、トマト、真菌のRNaseの塩基認識機構は基本的に同一と考えられる。この研究により今後のトマトRNase Le等の植物RNaseの作用機構の解明に突破口を開いたと考えている。