ADPリボシル化因子(ARF)の阻害による癌細胞増殖抑制の試み

尝试通过抑制 ADP-核糖基化因子 (ARF) 来抑制癌细胞生长

• 批准号: 08266256
• 负责人: 照井 健
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Sapporo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08266256/
• 关键词: ADPリボシル化因子(ARF); ホスフォリパーゼD; 細胞増殖; 癌細胞; ホスファチジン酸; ホスファチジルコリン; 印環細胞癌; Breferudin A

癌細胞の増殖におけるADPリボシル化因子(ARF)-ホスフォリパーゼD(PLD)シグナルの意義を明らかにするために以下の検討を行った。1.細胞内ARFの発現:腫瘍細胞におけるARFの発現は、一次抗体として抗ARFモノクロナル抗体(Dr.R.A.Kahn Emory Univ.GA.USAより供与)を用いてウエスタンブロット法で検討した。ヒト腫瘍由来細胞株10種では発現量に差はあるものの全ての細胞にARFタンパクの発現を認めた。胃癌細胞由来細胞株の中で印環細胞癌および腺癌由来細胞の一部にARF発現の低下しているものがあった。2.PLD活性の測定:PLD活性の測定は、Brown et al.(Cell,75,1137-1144,1993)の方法に準じた。すなわち、細胞膜分画単独あるいは細胞膜、細胞質を可溶化しホスファチジルエタノールアミン(PE),4,5ホスファチジルビスホスフェート(PIP2)、ホスファチジルコリン(PC),の混合ミセル中で[3H]PCを基質として測定した。ミリスチン化リコンビナントARF1タンパクを調整し、PLD活性に及ぼす影響を検討した。HL60細胞におけるPLD活性を細胞膜に認め、同活性はSuMのARFおよび30uMのGTPγSの添加により約5倍に促進された。胃癌細胞株OCUM-1のPLD活性もまた、細胞膜のみでは活性が低かったが、5uM ARFおよび30uM GTPγSの添加により約2.5倍に刺激された。3.細胞増殖速度とPLD活性:HL60細胞をserum starvationにより増殖速度を変化させ、PLD活性を測定したところ、低濃度血清で培養した細胞のPLD活性は通常の血清濃度で培養した細胞の約70%に低下した。以上より癌細胞にはARF-PLDシグナルが存在し細胞増殖に関与している可能性が考えられた。今後ARF-PLDシグナルの阻害により細胞の増殖に与える影響を検討する予定である。この目的のためにARFの活性化を抑制するBrefeldin A処理および点変異arf遺伝子の導入が有力な手段と考えられる。

癌细胞发现ADP磷酸化因子（ARF）-ADP磷酸化因子D（PLD）磷酸化酶的特异性，明确了癌细胞的增殖和分化过程，并在此基础上进行了筛选。1.细胞内ARF诊断：抗ARF细胞内ARF诊断试剂，一种抗体夹心法抗ARF细胞内ARF抗体（Dr.R.A.Kahn Emory Univ.GA.USA申请供与）。由于来癌细胞株10例急性肾衰竭量不足，全正常人的肾细胞ARF发生了急性肾衰竭。肺癌细胞由于癌细胞株中的低印肺癌细胞癌细胞的低分化，由于癌细胞的一部分ARF细胞的低分化下形成了一种恶性肿瘤。2.PLD活性测定：PLD活性测定法，Brown et al. (Cell，75，1137 - 1144，1993）的方法来确定。胶原蛋白、细胞膜分离提取的胶原蛋白、胶原蛋白可化的胶原蛋白、胶原蛋白酶解的胶原蛋白（PE）、4，5-二羟甲基纤维素酶解的胶原蛋白（PIP2）、胶原蛋白酶解的胶原蛋白（PC）、胶原混合的胶原蛋白中的[3H]PC基胶原蛋白酶形成的固定化酶。体外培养细胞凋亡抑制剂ARF1、PLD活性抑制剂及免疫抑制剂。HL60细胞凋亡诱导PLD活性细胞膜增殖，同活性SuM ARF表达量为30 μ M的GTPγS掺入量为5倍的促凋亡剂。胃癌细胞株OCUM-1可使PLD活性降低，癌细胞膜增殖活性降低，5 μ M ARF可使30 μ M GTPγS掺入量增加到2.5倍刺激量。3.细胞发现度测定PLD活性：HL60细胞血清饥饿培养要求发现低速加速转化率，PLD活性测定结果显示，低血清饥饿条件下，HL 60细胞PLD活性通常在血清饥饿程度低于正常对照组细胞数的70%以下。以上申请均为ARF细胞移植患者中存在的癌细胞增殖和转移的可能性试验。ARF-PLD是一种抗肿瘤的免疫抑制剂，它要求细胞增殖被发现并与造影剂结合使用。目的的急性呼吸窘迫综合征ARF活化抑制剂Brefeldin A人工神经刺激点ARF中子刺激进入强力刺激手段试验。

项目成果

Randazzo R.A.et al: "The amino terminus of ADP-ribosylation factor (ARF)1 is essential for interaction with Gs and ARF GTP ase-activating protein." J.Biol.Chem.269. 29490-29494 (1994)

Randazzo R.A. 等人：“ADP-核糖基化因子 (ARF)1 的氨基末端对于与 Gs 和 ARF GTP 酶激活蛋白的相互作用至关重要。”

Sakamaki S.et al: "Long term survaival and differentiation of human poripheral blood CD34+cells in SCID mice." Int J Hematol.(in press).

Sakamaki S.et al：“SCID 小鼠中人外周血 CD34 细胞的长期存活和分化。”

Kahn R.A.et al: "Mutationl analysis of Saccharomyces cerevisiae ARF1." J.Biol.Chem.270. 143-150 (1995)

Kahn R.A.等人：“酿酒酵母 ARF1 的突变分析。”

Cavenagh M.M.et al: "ADP-ribosylation factor (ARF)-like 3,a new member of the ARF family of GTP-binding proteins cloned from human and rat tissues." J.Biol.Chem.269. 18937-18942 (1995)

Cavenagh M.M.等人：“ADP-核糖基化因子 (ARF) 样 3，是从人和大鼠组织中克隆的 GTP 结合蛋白 ARF 家族的新成员。”

Terui T.et al: "Effect of Acid phospholipids on nucleotide exchange propeties of ADP-ribosylation factor I" J.Biol.Chem.269. 28130-28135 (1994)

Terui T.等人：“酸性磷脂对 ADP-核糖基化因子 I 的核苷酸交换特性的影响”J.Biol.Chem.269。