酵素発生型光合成系の分子構築の動態を制御するプロテアーゼの研究

控制酶促光合系统分子组装动力学的蛋白酶研究

基本信息

批准号：
08278219
负责人：
佐藤公行
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

光合成・光化学系II反応中心のサブユニットの1つであるD1タンパク質は,そのC-末端に8〜16のアミノ酸よりなる延長部分を持つ前駆体として合成され,核支配のプロテアーゼの作用により成熟化する。本研究ではこの過程に関与するプロテアーゼをホウレンソウ葉緑体から純化することに成功し,そのアミノ酸配列情報に基づき,これをコードするcDNAの同定とその塩基配列の決定を行った。その結果,この酵素はN末に150のアミノ酸よりなる前配列を持ち,この部分は葉緑体包膜通過とチラコイド膜通過のシグナルとして機能するものであると推定された。ついで,この酵素遺伝子を大腸菌内での活性を持つ状態で大量発現する系を開発するとともに,His-tagを利用することによりその純化を可能にし,純化された酵素を用いて,基質認識機構や反応機構の解析を行った。その結果,この酵素は既知のプロテアーゼ阻害剤の阻害を受けないこと,また,その触媒する反応の最適pHが7.7と,その機能部位と考えられる葉緑体チラコイドルーメンのそれと大きく異なっていることなど,数多くの新知見がもたらされた。一方,これまでに行ったin vitroの解析を基礎に,クラミドモナスを用いて,基質であるD1タンパク質のプロセシング部位(Ala-344)のC-側に位置するアミノ酸の置換体(Ser,Phe,Cys,Gly,Val)をin vivoで作成し,その生存への効果を,混合培養系を用いて調べた結果,オリゴペプチドを用いて行った解析の結果が細胞の生存性にも反映することが確認された。

D1蛋白是光合作用和光系统II反应中心的亚基之一，被合成为前体，其C-末端在其C-末端延伸8至16个氨基酸，并通过核控制蛋白酶的作用成熟。在这项研究中，我们成功地纯化了菠菜叶绿体中涉及的蛋白酶，并基于氨基酸序列信息，我们鉴定了编码它的cDNA并确定了其碱基序列。结果，据估计，该酶在N末端具有150个氨基酸的前序列，并且该部分作为叶绿体封装和类囊体膜转运的信号。接下来，开发了该酶基因在大肠杆菌内的活跃状态中以大量活跃状态表达的系统，并使用HIS-TAG通过使用纯化酶对底物识别机制和反应机制进行了纯化。结果导致了许多新发现，例如，已知蛋白酶抑制剂不会抑制该酶，并且其催化反应的最佳pH值为7.7，与叶绿体类囊样腔的最大差异有显着不同，被认为是其功能部位。另一方面，基于到目前为止我们进行的体外分析，我们在位于基板D1蛋白（ALA-344）的C侧上创建了氨基酸取代（Ser，Phe，Phe，Cys，Gly，Gly，Val，Gly，Val，Val，val，val）生存能力。