DNA・タンパク質相互作用の1分子イメージングと計測

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DNAの相同組み換えの過程において十字型構造をしたHolliday構造DNAが形成され、この十字型分岐点の移動により組み換えが進行する。分岐点移動反応にはRuvABタンパク質複合体が関与する。RuvAはHolliday構造に特異的に結合するタンパク質である。また、RuvAはRuvBと複合体を形成する。RuvBは六量体のリング構造を形成し、RuvAの両側からはさむように結合する。分岐点の移動はモータータンパク質であるRuvBのATP加水分解のエネルギーを利用して行われる。我々はRuvABタンパク質複合体によるHolliday構造DNAの分岐点移動を光学顕微鏡で直接検出することを試みた。RuvABによる分岐点移動が起こるときDNAの回転がおこる。そこで、この回転運動を検出することにした。まず、観察に必要な十字型構造のDNAを作製した。そしてその十字型構造DNAの一方をスライドガラス基板に固定し、もう片側に磁気ビーズを付け、磁石で引っ張りあげた。そこにRuvA、RuvBタンパク質を加え、RuvAB-Holliday構造複合体を形成させ、エネルギー源であるATPを加え、ビーズの動きを観察する。RuvBがHolliday構造DNAの上下方向に結合すると、DNAを上下方向に押し出すようにして、DNAは反時計方向にねじれ、反時計方向のビーズの回転が観察されることが予想される。左右方向にRuvBが結合した場合、ビーズの回転は時計回りになる。これまでに、何例かビーズの回転が観察された。今後、さらにこのビーズの回転を詳細に観察し、これまでの生化学的解析からでは測定が困難であった分岐点移動反応の速度や1分子のATPの加水分解にともなって移動するDNAの長さ等の測定を行い、RuvABタンパク質複合体よるHolliday構造DNAの分岐点移動反応のメカニズムを明らかにしたい。