DNA・タンパク質相互作用の1分子イメージングと計測

DNA-蛋白质相互作用的单分子成像和测量

• 批准号: 11242204
• 负责人: 原田 慶恵
• 金额: $ 62.78万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research (2001-2003)Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience (2000)Keio University (1999)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11242204/
• 关键词: 生物物理; 分子モーター; 1分子計測; 可視化; 酵素反応; DNA; タンパク質; RNAポリメラーゼ; イメージング; 顕微鏡; 転写

DNAの相同組み換えの過程において十字型構造をしたHolliday構造DNAが形成され、この十字型分岐点の移動により組み換えが進行する。分岐点移動反応にはRuvABタンパク質複合体が関与する。RuvAはHolliday構造に特異的に結合するタンパク質である。また、RuvAはRuvBと複合体を形成する。RuvBは六量体のリング構造を形成し、RuvAの両側からはさむように結合する。分岐点の移動はモータータンパク質であるRuvBのATP加水分解のエネルギーを利用して行われる。我々はRuvABタンパク質複合体によるHolliday構造DNAの分岐点移動を光学顕微鏡で直接検出することを試みた。RuvABによる分岐点移動が起こるときDNAの回転がおこる。そこで、この回転運動を検出することにした。まず、観察に必要な十字型構造のDNAを作製した。そしてその十字型構造DNAの一方をスライドガラス基板に固定し、もう片側に磁気ビーズを付け、磁石で引っ張りあげた。そこにRuvA、RuvBタンパク質を加え、RuvAB-Holliday構造複合体を形成させ、エネルギー源であるATPを加え、ビーズの動きを観察する。RuvBがHolliday構造DNAの上下方向に結合すると、DNAを上下方向に押し出すようにして、DNAは反時計方向にねじれ、反時計方向のビーズの回転が観察されることが予想される。左右方向にRuvBが結合した場合、ビーズの回転は時計回りになる。これまでに、何例かビーズの回転が観察された。今後、さらにこのビーズの回転を詳細に観察し、これまでの生化学的解析からでは測定が困難であった分岐点移動反応の速度や1分子のATPの加水分解にともなって移動するDNAの長さ等の測定を行い、RuvABタンパク質複合体よるHolliday構造DNAの分岐点移動反応のメカニズムを明らかにしたい。

DNA の み in same group え の process に お い て cross structure を し た Holliday construct DNA が form さ れ, こ の cross bifurcation point の mobile に よ み り group in え が for す る. The bifurcation point shifts against 応に タ RuvABタ パ パ the が mass complex が and する. RuvA <s:1> Holliday constructs に specific に binding するタ するタ パ パ wood である. The また and RuvA RuvBと complexes を form する. The <s:1> hexahedral structure of RuvB リ グ グ を forms a を, and the two sides of RuvA <s:1> ら ら さむように さむように combine to する. Bifurcation point の mobile は モ ー タ ー タ ン パ ク qualitative で あ る RuvB の ATP hydrolysis の エ ネ ル ギ ー を using し て line わ れ る. I 々 は RuvAB タ ン パ ク qualitative complex に よ る Holliday construct DNA の bifurcation point mobile を optical 顕 で 検 directly from the micro mirror す る こ と を try み た. The RuvABによる bifurcation point moves が from <s:1> ると <s:1> DNA <s:1> back to 転がお 転がお る る. Youdaoplaceholder0 そ で, で, を検 back to 転 motion を検 out する とに とに た た た た た た た た. Youdaoplaceholder0, 観 to observe に, it is necessary to な cross-shaped structure <s:1> DNAを for making た た. DNA の そ し て そ の cross structure side を ス ラ イ ド ガ ラ ス substrate に fixed し, も う piece side に magnetic 気 ビ ー ズ を pay け, magnet で lead っ り あ げ た. そ こ に RuvA, RuvB タ ン パ ク quality を plus え, RuvAB - Holliday tectonic complex を form さ せ, エ ネ ル ギ ー source で あ る を え, ATP ビ ー ズ の dynamic き を 観 examine す る. RuvB が Holliday construct DNA の に combined with up and down direction す る と, DNA に を up and down direction and し す よ う に し て, DNA は chronometer direction に ね じ れ chronometer and anti direction の ビ ー ズ の back planning が 観 examine さ れ る こ と が to think さ れ る. To the left and right, the にRuvBが is combined with the <s:1> た occasion, the ビ ズ ズ ズ <s:1> returns to the 転 転 timepiece returns to the になる になる. Youdaoplaceholder2 れまでに, how do you give an example? Youdaoplaceholder1 ビ ズ ズ ズ 転が観 check された. In the future, さ ら に こ の ビ ー ズ の back planning を detailed に 観 し, こ れ ま で の biochemical analytical か ら で は determination が difficult で あ っ た bifurcation point move against 応 の speed や 1 molecular の ATP の hydrolytic decomposition に と も な っ て mobile す る long DNA の さ の determination を い, RuvAB タ ン パ ク qualitative complex よ る Holliday tectonic DN A <s:1> bifurcation point moves the reverse 応 応 メカニズムを Ming ら に に た た た.

项目成果

原田慶恵: "「DNAモーターを測る」ナノテクノロジーハンドブックIV編 バイオ・化学へ使う 6章3(ナノテクノロジーハンドブック編集員会編)"オーム社. 213 (2003)

Yoshie Harada：“测量 DNA 电机”纳米技术手册第 IV 卷，在生物和化学中的应用，第 6 章、第 3 章（由纳米技术手册编辑委员会编辑），Ohmsha。

原田慶恵: "「生体分子の1分子イメージング」生命の科学と工学-その最先端"三共出版(印刷中).

原田芳惠：“‘生物分子的单分子成像’——生命科学与工程的前沿”三共出版社（出版中）。

座古保: "生体機能を1分子レベルで探る-1分子蛍光イメージング-"分光研究. 51. 3-14 (2002)

Zakoyasu：“探索单分子水平的生物功能 - 单分子荧光成像”光谱研究 51. 3-14 (2002)。

Harada, Y.: "Studies on Biomolecules Using Single Molecule Imaging and Manipulation Techniques."Science and Technology of Advanced Materials. (in press).

Harada, Y.：“利用单分子成像和操作技术进行生物分子研究。”先进材料科学与技术。

原田慶恵: "RNAポリメラーゼによるDNAの回転をみる(イメージングで解き明かす生命機能 第3回)"実験医学. 21(13). 1800-1801 (2003)

Yoshie Harada：“通过 RNA 聚合酶观察 DNA 的旋转（通过成像阐明生命功能，第 3 部分）”实验医学 21(13)。