1細胞内生体分子の定量的計測法の開発

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1細胞内に含まれるタンパク質の量や酵素活性、細胞が分泌するタンパク質の量の解析は、細胞レベルの生理学的、病理学的研究に重要である。そこで我々は、1個の細胞を容積が10-30ピコリットルのマイクロウェル内に閉じこめ、その中に分泌されたタンパク質を定量する方法を開発した。マイクロウェルは、20-40マイクロメートル四方、深さ20マイクロメートルのくぼみが多数ある、厚さ1ミリのpoly-dimethylsiloxane(PDMS)製のシートをカバーガラス上に接着させることによって作製した。このマイクロウェル内に1個の細胞を閉じこめ、数時間培養することが可能である。検出したいタンパク質の抗体を結合させたビーズを光ピンセットで操作し、基板上に光化学反応で固定することによって、ウェル内に、数～数十種類の異なる抗体ビーズをアレイ化できる。そこで、このシステムを使って、マウスハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体の産生能のモニターを試みた。抗マウスIgG(Fc)抗体をマイクロビーズに固定化し、産生される抗体に対する抗原を蛍光標識したものをあらかじめ溶液中に加えておき、産生抗体と蛍光標識抗原の複合体のビーズへの結合を検出することによってハイブリドーマが分泌するタンパク質を検出することができた。もう一つ別な方法として、ガラス基板上に直接抗マウスIgG(Fc)抗体を固定化し、量子ドット(Qdot)標識抗原と産生抗体の複合体の基板上への結合を検出する方法を考案した。この方法では、一度に検出できるタンパク質の種類は制限されるが、ビーズをアレイ化する必要がないので、より簡便に分泌タンパク質の解析ができる。今回我々が開発した方法を用いることによって、抗体産生能の高いハイブリドーマを簡便にスクリーニングすることが可能である。