1細胞内生体分子の定量的計測法の開発

1细胞内生物分子定量测定方法的开发

• 批准号: 20034059
• 负责人: 原田 慶恵
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20034059/
• 关键词: 1細胞; タンパク質定量; PDMS; マイクロウェル; ハイブリドーマ; マイクロビーズ

1細胞内に含まれるタンパク質の量や酵素活性、細胞が分泌するタンパク質の量の解析は、細胞レベルの生理学的、病理学的研究に重要である。そこで我々は、1個の細胞を容積が10-30ピコリットルのマイクロウェル内に閉じこめ、その中に分泌されたタンパク質を定量する方法を開発した。マイクロウェルは、20-40マイクロメートル四方、深さ20マイクロメートルのくぼみが多数ある、厚さ1ミリのpoly-dimethylsiloxane(PDMS)製のシートをカバーガラス上に接着させることによって作製した。このマイクロウェル内に1個の細胞を閉じこめ、数時間培養することが可能である。検出したいタンパク質の抗体を結合させたビーズを光ピンセットで操作し、基板上に光化学反応で固定することによって、ウェル内に、数～数十種類の異なる抗体ビーズをアレイ化できる。そこで、このシステムを使って、マウスハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体の産生能のモニターを試みた。抗マウスIgG(Fc)抗体をマイクロビーズに固定化し、産生される抗体に対する抗原を蛍光標識したものをあらかじめ溶液中に加えておき、産生抗体と蛍光標識抗原の複合体のビーズへの結合を検出することによってハイブリドーマが分泌するタンパク質を検出することができた。もう一つ別な方法として、ガラス基板上に直接抗マウスIgG(Fc)抗体を固定化し、量子ドット(Qdot)標識抗原と産生抗体の複合体の基板上への結合を検出する方法を考案した。この方法では、一度に検出できるタンパク質の種類は制限されるが、ビーズをアレイ化する必要がないので、より簡便に分泌タンパク質の解析ができる。今回我々が開発した方法を用いることによって、抗体産生能の高いハイブリドーマを簡便にスクリーニングすることが可能である。

1. It is important to study the quantity and enzyme activity of intracellular substances, the analysis of the quantity of intracellular substances secreted by cells, and the physiology and pathology of cellular processes. A method for quantifying the amount of protein secreted in a cell with a capacity of 10-30 mg/kg was developed. The polydimethylsiloxane (PDMS) system is composed of 20-40 tetragonal, 20-40 tetragonal, 20 tetragonal, 20 - 40 tetragonal, 20 tetragonal, 20 - 40 tetragonal, 20 tetragonal, 20 tetra A cell in the cell is cultured for several times. The antibody binding system of the present invention can be operated on a substrate by photochemical reaction, and can be used to immobilize several kinds of antibodies. This is the first time I've ever seen a doctor. Anti-IgG (Fc) antibodies are immobilized, produced, and labeled in solution. Anti-IgG (Fc) antibodies are produced, labeled, and labeled in solution. Anti-IgG (Fc) antibodies are produced, labeled, and labeled in solution. A method for immobilizing direct anti-IgG (Fc) antibody on a substrate, a method for detecting binding of a Qdot labeled antigen to a substrate producing an antibody complex, and a method for detecting binding of the antibody complex to the substrate were investigated. This method is simple and easy to detect and analyze the type of protein. Now we have developed a new method for antibody production, which is very simple and easy to use.

项目成果

Single-molecule visualization of the oligomeric form of Escherichia coli UvrDhelicase in vitro

大肠杆菌 UvrDhelicase 寡聚形式的体外单分子可视化

• 发表时间: 2010
• 作者: Yuko Ayabe Chujo;Yoshie Harada;Hiroaki Yokota
• 通讯作者: Hiroaki Yokota

A simple single-cell chemical lysis method for analyses of intracellular molecules using a picoliter-scale microwell array

一种使用皮升规模微孔阵列分析细胞内分子的简单单细胞化学裂解方法

• 发表时间: 2008
• 作者: Sasuga;Y.;Iwasawa;T.;Ooe;Y.;Ohara;O. and Harada;Y
• 通讯作者: Y

Hydrophilic Fluorescent Nanogel Thermometer for Intracellular Thermometry

• DOI: 10.1021/ja807714j
• 发表时间: 2009-03-04
• 期刊: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
• 影响因子: 15
• 作者: Gota, Chie;Okabe, Kohki;Uchiyama, Seiichi
• 通讯作者: Uchiyama, Seiichi

Determination of the number of DNA helicase UvrD in its functional unit by single-molecule analysis.

通过单分子分析测定其功能单元中 DNA 解旋酶 UvrD 的数量。

• 发表时间: 2009
• 作者: Yuko Chujo;Yoshie Harada;Hiroaki Yokota
• 通讯作者: Hiroaki Yokota

蛍光顕微鏡

荧光显微镜

• 发表时间: 2010