1細胞内生体分子の定量法の開発

1细胞内生物分子定量方法的发展

• 批准号: 18038047
• 负责人: 原田 慶恵
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038047/
• 关键词: 全反射顕微鏡; マイクロアレイ; マイクロビーズ; 生体分子

1細胞中に存在する酵素の活性を計測する技術の開発を行った。まず、多数の凹(40×40×20μm^3)のあるPDMSマイクロチャンバーチップ上に細胞をまき、凹部に細胞を収めた後、ペプチドのC端に蛍光色素を結合させたFluorogenic基質を細胞溶解液と共に流し込み、カバーガラスを載せ、PDMSチップをガラス面に圧着し、約30pLの微小空間に細胞を閉じこめた。Fluorogenic基質はそのままでは蛍光を発しないが、酵素によってペプチドと蛍光色素の間で切断されると蛍光色素が放出され、蛍光を発する。細胞がチャンバー内で溶解され、細胞内の酵素が溶出すると、酵素が基質の切断を開始し、蛍光シグナルが時間とともに増加していく。蛍光強度の時間変化から、1個の細胞に含まれていた酵素の分子数を推定することができる。ラットPC12細胞のCa2+依存性プロテアーゼであるカルパインを1細胞レベルで計測すると、Ca2+存在下では、基質であるSuc-LLVY-MCAが分解され、蛍光分子(AMC)が放出され、チャンバー内の蛍光強度が時間と共に増加した。一方、EDTAでCa2+をキレートするとこの活性は、ほとんど認められなかった。また、カルパイン阻害剤であるZLLHやカルパスタチンを添加すると、Ca2+存在下でも完全に活性は抑制されていることを確認した。次に、アポトーシスを起こした細胞で活性が上昇することが知られているカスパーゼ活性を、個々の細胞でカスパーゼのFluorogenic基質を用いて調べた。培養液から血清を抜き、アポトーシスを誘導した細胞と、通常の血清を含む培地で、培養した細胞で測定し比較した。その結果、アポトーシスを誘導した細胞の中にはカスパーゼ活性が高い細胞が存在した。カスパーゼ活性が高い細胞が本当にアポトーシスを起こしているかどうかを確認することが、今後の課題である。

Development of a technique for measuring the activity of enzymes present in cells The cells in the concave part (40×40×20μm^3) of the PDMS matrix were separated from each other, and the cells in the concave part were separated from each other, and the fluorescent pigment in the C-terminal of the concave part was combined with the Fluorogenic matrix. The cells in the small space of about 30pL were separated from each other. Fluorogenic substrates emit light, enzymes emit light, and fluorescent pigments emit light. Cell lysis, enzyme dissolution, enzyme substrate cleavage, and time for cell lysis increase. The temporal variation of light intensity and the molecular number of enzymes contained in one cell were estimated. Ca2 +-dependent changes in PC12 cells were measured in the presence of Ca2 +, in the presence of matrix, in the decomposition of Suc-LLFY-MCA, in the release of fluorescent molecules (AMC), and in the intensity of fluorescent light increased with time. One side, EDTA, Ca2+, Ca2 +, Ca ZLLH and Ca2 + were added to the reaction mixture, and the reaction mixture was completely inhibited. The activity of the cells was increased and the activity of the cells was modulated. Culture medium: serum, culture medium: cell culture medium: serum, culture medium: The result is that the cells are highly active. The activity of the cells is high.

项目成果

Dynamic polymorphism of Ras observed by single molecule FRET is the basis for molecular recognition

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2006.03.031
• 发表时间: 2006-05-12
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Arai, Y;Iwane, AH;Yanagida, T
• 通讯作者: Yanagida, T

ナノバイオ辞典 一分子観察,蛍光顕微鏡,蛍光色素,光ピンセット.

纳米生物词典 单分子观察、荧光显微镜、荧光染料、光镊。

• 发表时间: 2007
• 作者: Nishinaka;T.;貴家康尋;原田慶恵;原田慶恵
• 通讯作者: 原田慶恵

1分子蛍光測定におけるブリンキングの問題

单分子荧光测量中的闪烁问题

• 发表时间: 2006
• 期刊: 生物物理 46・3
• 作者: Miki;T.;Arai Y.;横田浩章
• 通讯作者: 横田浩章

バイオマシン・生物分子モーター

生物机器/生物分子马达

• 发表时间: 2006
• 期刊: 細胞工学 25・8
• 作者: Han;Y-W.;原田慶恵
• 通讯作者: 原田慶恵

DNA,RNAポリメラーゼ. 生物物理学ハンドブック

DNA、RNA聚合酶。

• 发表时间: 2007
• 作者: Yamasaki;C.;Murakami;K.;Fujii;Y.;Sato;Y.;Harada;E.;Yura;K. (66th);Shionyu;M. (101th);Go;M. (107th);Gojobori;T. (138th);原田慶恵;原田慶恵
• 通讯作者: 原田慶恵