哺乳動物の生殖反応マシーナリーの構造機能解析

哺乳动物生殖反应机制的结构和功能分析

• 批准号: 13033004
• 负责人: 中野 實
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033004/
• 关键词: 透明帯; 糖タンパク質; 哺乳類卵子; 受精; 細胞間認識; sf9細胞; バキュロウィルス; 結晶化; Sf9細胞

1.ブタのZPBおよびZPCの三次構造解析透明帯を調製する際、凍結卵巣の固まりを低温室内でスライスする過程は重労働であるが、今回、これまで1時間かかっていた作業を、氷冷しつつ5分で終了し得る電動式スライサーを試作した。また、これまではステンレスメッシュにトラップした透明帯を水中で加熱し溶解していたが、透明帯糖タンパク質に僅かに存在するSH基が引き金になってSS交換反応が起こりポリマーが形成されることがわかった。そこで酢酸で可溶化後アンモニアで中和しポリマーの形成を抑制する調製法を工夫した。これらの改良法で効率良く透明帯糖タンパク質を得ることが可能となった。このようにして得た透明帯糖タンパク質混合物をエンド-β-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびβ-ヘキソサミニダーゼの3酵素で同時消化し、レクチンブロットで充分に消化されていることを確認後、逆相HPLCで3成分に分別した。主成分のZPBとZPCについてハンギングドロップ法で結晶化を試みている。2.ブタとウシ透明帯タンパク質のバキュロウィルスを用いた発現と構造機能解析昨年度までにバキュロウィルス/sf9昆虫細胞発現系を構築したブタとウシ透明帯糖タンパク質ZPA、ZPB、ZPC、ウシZPBの糖鎖付加部位変異体およびウシZPAのドメイン欠失変異体の大量発現条件を検討すると共に、発現タンパク質の精子結合活性を調べた。いずれのタンパク質も糖鎖が付いているせいか、発現量は少なく更に条件を検討中である。また、発現させたブタ透明帯タンパク質には、高マンノース型糖鎖が付加しているため、ブタ精子は結合せずウシ精子が結合することがわかった。

1. ZPB and ZPC's third order structure analysis transparent band modulation, frozen egg solidification, low temperature room process repeated, this time, 1 time, the operation, cooling, 5 minutes, the end of the electric type of service test. In addition, the transparent sugar is dissolved by heating in water, and the transparent sugar is only present in the SH group. A modulation method is used to neutralize and inhibit the formation of a soluble acid. The improved method is very effective. The three enzymes of the transparent sugar mixture were digested simultaneously and fully by reverse phase HPLC. After confirmation, the three components were separated. ZPB and ZPC are the main components. 2. Construction and functional analysis of insect cell development system of transparent matrix protein ZPA, ZPB, ZPC, ZPB, ZPB, ZPA, ZPA, ZPB, ZPA, ZPB, ZPA, Z In the middle of the discussion, the quality of the sugar lock is changed, and the quantity of the occurrence is changed. In addition, the sperm binding mechanism can also be used to detect the presence of a high level of sperm binding.

项目成果

K.Ikeda: "Localization of N-linked carbohydrate chains in glycoprotein ZPA of the bovine egg zona pellucida"European Journal of Biochemistry. 269・17. 4257-4266 (2002)

K.Ikeda：“牛卵透明带糖蛋白 ZPA 中的 N 连接碳水化合物链的定位”欧洲生物化学杂志 269・17（2002 年）。

M.Nakano: "Sperm binding activity of the recombinant pig zona pellucida glycoproteins expressed in a baculovirus/insect cell expression system"Cloning and Stem Cells. 4・3. 293-294 (2002)

M.Nakano：“杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达的重组猪透明带糖蛋白的精子结合活性”《克隆和干细胞》293-294。

M.Nakano: "Sperm binding activity of the recombinant pig zona pellucida glycoproteins expressed in a baculovirus/insect cell expression system"Cloning and Stem Cells. (in press). (2002)

M.Nakano：“杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达的重组猪透明带糖蛋白的精子结合活性”克隆和干细胞。

N.Yonezawa: "Molecular cloning of bovine zona pellucida glycoproteins ZPA and ZPB and analysis for sperm-binding component of the zona"European Journal of Biochemistry. 268・12. 3587-3594 (2001)

N.Yonezawa：“牛透明带糖蛋白ZPA和ZPB的分子克隆以及透明带精子结合成分的分析”欧洲生物化学杂志268・12（2001）。

S.Amari: "Essential role of the nonreducing terminal α-mannosyl residues of the N-linked carbohydrate chain of bovine zona pellucida glycoproteins in sperm-egg binding"Molecular Reproduction and Development. 59・2. 221-226 (2001)

S.Amari：“牛透明带糖蛋白 N 连接碳水化合物链的非还原性末端 α-甘露糖基残基在精卵结合中的重要作用”，《分子生殖与发育》221-226。