EF-handカルシウム結合モチーフを持つタンパク質のX-線結晶構造解析

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EF-handモチーフは多くのタンパク質に存在するカルシウム結合ドメインであり、タンパク質の活性化及び他のタンパク質との相互作用に関わると考えられている。本研究では、EF-handモチーフを持つS100A13,S100A14,VILIP-1の機能を解明する為に、X-線結晶構造解析法によりタンパク質の三次構造の決定をめざした。S100A13タンパク質はカルシウム結合型の結晶化に成功し(2006年論文発表)、X-線回折データを得て結晶構造を決定した(投稿中)。S100A13は銅イオンとの結合も報告されており、S100A13の銅結合型の結晶化条件を決定し最適化を行った。S100A14はヒト腎臓cDNAライブラリーからクローニングし、pET42b(+)ベクターに挿入、BL21(DE3)発現用大腸菌をトランスフォーム後、発現を誘導した。S100A14は可溶性タンパク質として発現し、His-bindクロマトグラフィー、Ammonium sulfate沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの順で精製を行った。結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法でCrystal Screen HT及びWizard I、 IIを用いて行った。PEG8000を沈殿剤とした条件の最適化を行った。VILIP-1はヒト脳cDNAライブラリーからクローニングし、pET42b(+)ベクターに挿入、BL21(DE3)発現用大腸菌をトランスフォームした。発現した可溶性VILIP-1タンパク質はHis-bindクロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィーの順で精製した。結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法でCrystal Screen HT, Wizard I、 IIを用いて条件検討を行った。得られた結晶化条件の最適化を行った。