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哺乳類の受精における多精拒否機構の研究

哺乳动物受精中多精子排斥机制的研究

基本信息

批准号：
03640595
负责人：
中野實
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03640595/
关键词：
透明帯哺乳類卵子受精卵体外受精多精拒否

项目摘要

哺乳類の多精拒否機構の解明をめざし、体外受精法でブタ受精卵を調製し受精による透明帯の特性や構造の変化を調べた。1.濾泡期の卵胞をもつブタ卵巣から卵丘に包まれた卵子を採取しTCM199A液中39℃で48時間5%CO_2下で培養し卵子を減数第二分裂中期まで成熟させた後、受精培養液に移した。2.一方、ブタ副精巣尾部から採取した精子をTCM199B液中37℃、70分間5%CO_2下で保温し受精能を獲得させた。3.成熟卵子に精子を媒精し39℃で12時間保温した。培養過程の卵子の状態は適時万能倒立顕微鏡(本補助金で購入)で観察し条件を検討しつつ実験を進めた。上記条件下で90%以上の受精率が達成された。4.卵巣内の未成熟卵子、成熟させた卵子および受精卵から透明帯を調製し、まず0.2%プロナーゼや希酸(pH3.6)による溶解速度を測定したところ、受精卵透明帯は40%ほど溶解速度が遅くなり、受精で透明帯が硬化するマウスで既報の現象がブタでもみられた。また温和な条件下FITCで透明帯をラベル後溶解しゲル濾過HPLCにかけ比較した結果、パターンに顕著な変化は見られず、微量画分ながら透明帯の単位構造の外側に位置するPZP2が最も修飾され易いことがわかり、透明帯全体の構造は大きくは変化しないものと思われた。しかし受精卵透明帯に結合する精子数が大巾に減ることから精子レセプターなどの微細な変化は起きていることが確認された。5.二次元泳動や二次元目は還元状態で行なう対角線電気泳動で詳細に調べたところ、PZP2に含まれる90K蛋白質のみが受精後完全に消失することがわかった。1万個以上の受精卵を得るという当初の目標に達せず、交付申請書に記したCDの測定とペプチドのマッピングはできなかったが、今後更に受精卵の調製に務める一方、蛍光試薬で修飾後酵素消化したペプチドをマッピングするなどの分析の微量化も計りたい。

Mammalian polyspermia mechanism analysis, in vitro fertilization method, fertilization, transparent zone characteristic structure adjustment 1. The eggs in the follicular phase were collected in TCM199A solution at 39℃ for 48 hours under 5% CO_2. After the eggs matured in the metaphase of meiosis, the fertilization medium was transferred. 2. The sperm was collected from the sperm and incubated in 5% CO_2 at 37℃ for 70 minutes. 3. Mature eggs are incubated at 39℃ for 12 hours. The condition of the eggs during cultivation is monitored by a universal inverted microscope (purchased with this grant). Under the above conditions, the fertilization rate of more than 90% was achieved. 4. The rate of dissolution of immature eggs, mature eggs and fertilized eggs in the transparent zone was measured by 0.2% pH (pH3.6). The rate of dissolution of fertilized eggs in the transparent zone was measured by 40% pH (pH3.6). The rate of dissolution of fertilized eggs in the transparent zone was measured by 40% pH (pH3.6). Under mild conditions, FITC transparent band was dissolved after filtration HPLC. Results of comparison, microanalysis, and microanalysis showed that PZP2 was the most modified in the outer position of the transparent band structure. The number of sperm cells in the transparent zone of the fertilized egg is reduced from large to small. 5. Two-dimensional swimming, two-dimensional vision and elemental state, line angle electrical swimming, detailed modulation, PZP2 contains 90K protein and completely disappears after fertilization. More than 10,000 fertilized eggs were obtained. The initial goal was achieved. The application form was delivered. The CD measurement was recorded. The future preparation of fertilized eggs was carried out. The enzyme digestion after modification was carried out. The analysis was carried out in a micro-scale.