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RNAi酵素複合体の実体解明と分子機能解析

RNAi酶复合物的实体阐明和分子功能分析

基本信息

批准号：
14035212
负责人：
善野修平
金额：
$ 1.79万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14035212/
关键词：
RNAi siRNA 二本鎖RNA Dicer eIF2C RISC

项目摘要

平成14年度は、ヒトとマウスのRNAi関連PAZ蛋白質(Dicer, EIF2C)のcDNAクローニングを行なった。ゲノムのドラフト配列と完全長cDNA、ESTクローンの5'末端配列、コザック配列、5'-非翻訳領域のインフレーム終止コドンから、開始コドンを推定してRT-PCRプライマーを設計し、完全なコード領域を含むcDNA断片を得た。dicer遺伝子はヒト、マウスゲノム中に1コピーのみで(ヒトゲノム14q32,マウス12E)、一方eIF2Cは4コピー存在した。eIF2C2はヒトでゲノム8q24+3に、マウスで15D3に位置し、残りの3つはeIF2C4, eIF2C1, eIF2C3の順番でタンデムに連なっていた(ヒトゲノム1P34+2,マウス4D2+2)。ヒトとマウスのcounterparts同士はアミノ酸配列にして2%以内の相違が存在するのみであったが、EIF2C1-4のPAZドメインの上流に、新たな保存領域(PRPモチーフと命名)を見い出した。このPRPモチーフはRNAi関連蛋白質である線虫Rde-1、ハエAgo2には存在しないものの、カビQde2、線虫Alg-1, Alg-2には存在した。もしかすると、これはmiRNA活性に必要なモチーフかもしれない。次に、培養細胞系を用いてdicer、eIF2C1-4のsiRNA-RNAi効果への関与を調べたところ、dicerやeIF2C1-4をsiRNAでノックダウンした場合、siRNA-RNAi活性が弱められた。さらに、免疫沈降試験から、DicerとeIF2C1, 2が相互作用しえることを突き止めた。これらの知見は、哺乳類のDicerとeIF2C群がRISC成分として機能し、siRNA生成後のRNAi機構に関与することを示すものである。

In 2014, the cDNA of RNAi-related PAZ protein (Dicer, EIF2C) was released.ゲノムのドラフトalignment complete length cDNA, ESTクローンの5' end alignment, コザック alignment, 5'-non-translation domain のインフレームTerminal コドンから, start コドンを presumed してRT-PCR プライマーを design し, complete なコード field をcontaining cDNA fragments をget た. dicer伝子はヒト、マウスゲノム中に1コピーのみで(ヒトゲノム14q32, マウス12E), one side of eIF2C は4ピー exists. eIF2C2はヒトでゲノム8q24+3に、マウスで15D3に Positionし、 residual りの3つはeIF2C4, eIF2C1, eIF2C3's shunfan でタンデムに连なっていた(ヒトゲノム1P34+2, マウス4D2+2).ヒトとマウスのcounterparts同士はアミノacid coordination にしてのdeviation within 2% するのみであったが、EIF2C1-4のPAZドメインの上上に、新たなsaving field (PRPモチーフとname)を见い出した.このPRP モチーフはRNAi-related proteins nematode Rde-1, nematode Ago2 にはexisting しないものの, カビQde2, nematode Alg-1, Alg-2 にはexisting した.もしかすると、これはmiRNA activity is necessary なモチーフかもしれない. Second, cultured cell lines use いてdicer, eIF2C1-4's siRNA-RNAi effect is related to をadjusted べたところ, dicer's IF2C1-4 is a good example of siRNA and its siRNA-RNAi activity is weak.さらに, immune sedimentation test 験から, DicerとeIF2C1, 2 がinteraction しえることを出きstop めた.これらの知见は, mammals のDicer とeIF2C group がRISC component としてfunction し, siRNA generation のRNAi mechanism に关 and することを Show すものである.