RNAi酵素・RNA複合体及び関連蛋白質の構造解析
RNAi酶/RNA复合物及相关蛋白的结构分析
基本信息
- 批准号:13033007
- 负责人:
- 金额:$ 2.3万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
- 财政年份:2001
- 资助国家:日本
- 起止时间:2001 至 2002
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
平成14年度は、以下のことを検討した。ヒトとマウスのDicerとPIWI様蛋白に対応するcDNAを取得した。dicerはゲノム中に1コピーで、piwi様eIF2Cは4コピー存在した。ヒトDicerとEIF2C1全長について、GST融合とTRX融合での大腸菌発現系を検討したが、不溶性であった。一方、バキュロウイルス発現系ではヒト6xHis-Dicerは可溶化し、6xHis-EIF2C1は不溶化した。現在、結晶化用に全長Dicerを大量調製中である。また、古細菌Sulfolobus tokodaiiのPIWI蛋白の大腸菌発現系を検討したが、これも不溶化した。平成13年度に調製したDicerの6xHis-RbD(RNaseIIIドメイン(Rb)+二本鎖RNA結合ドメイン(D))は可溶性であったが、不活性体を含んでいた。不活性の原因は二本鎖RNA結合活性のDに由来していたので、次にRbのみの発現を検討した。Rb-6xHisはMonoQカラム上で均一でRNaseIII活性を有していた。結晶化スクリーニングの結果、リザーバー条件が25%エチレングリコールで結晶が得られ、R AXISで測定したところ、単位格子の角度がα、β、γ=90°、3軸の長さa=68,86Å、b=70,86Å、c=189,60Åの斜方晶で、空間群がP222であると分かった。現在、好熱菌Aquifex aelicus由来のRNaseIIIをサーチ分子として分子置換法で構造決定する作業を行なっている。また、RbDのRbでは活性中心のはずのGlu残基がPro残基に置換しているが、それを逆転させたP1730Eは野生型RbDと同程度の活性しか示さなかった。この結果は、現行のRNaseIII触媒活性モデルと合致せず、活性中心がGlu残基で説明できないことを意味している。
The year of Pingcheng in 14, and the following is the following. Dicer, PIWI, protein, cDNA, get the protein. There is a link between 1 and 4 in dicer, eIF2C and 4. The whole length of E. coli EIF2C1, the fusion of GST and TRX, the strain of E. coli, the strain of insoluble bacteria. On the other hand, the 6xHis-Dicer is soluble and the 6xHis-EIF2C1 is insoluble. At present, the full-length Dicer is used in a large number of cases. Sulfolobus tokodaii, Archaea, PIWI protein, Aspergillus spp., Archaea, PIWI protein, Archaea, Archaea In the 13th year of Pingcheng, the 6xHis-RbD (RNaseIII drugs (Rb) + ordinary universities RNA combined with drugs (D)) was soluble, while the inactive body contained it. The reason for the inactivity is that the RNA of ordinary universities combined with active drugs has its origin, and that of secondary Rb universities shows that there is no significant difference between them. There is a homogenization of RNaseIII activity on the Rb-6xHis MonoQ test. Results the results of crystallization, 25% temperature, 25% temperature, R AXIS, α, β, γ = 90 °, 68, 7086, 18960rhombohedral, P222 were obtained. Now, the cause of good bacteria Aquifex aelicus is to determine the operation cost of the operation by using the method of molecular placement to determine the operation of RNaseIII bacteria. RbD, RbD, Rb, active center, Glu residue, Pro residue, reverse enzyme, P1730E, wild type RbD showed the same degree of activity. The results showed that the RNaseIII catalyst activity was combined with Glu residue in the active center, and that the Glu residue in the active center showed that the activity was not affected.
项目成果
期刊论文数量(12)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Woo Cheol Lee: "Crystallographic analysis of flavin oxidoreductase from Helicobacter pylori responsible for its susceptibility to antibiotic metronidazole"Flavins and Flavoproteins. (in press). (2003)
Woo Cheol Lee:“幽门螺杆菌黄素氧化还原酶的晶体学分析,导致其对抗生素甲硝唑的敏感性”黄素和黄素蛋白。
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- 通讯作者:
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Masahiro Sakurai:“鉴定 NfsA 中可能的底物特异性决定因素,NfsA 是大肠杆菌中主要的氧不敏感硝基还原酶”黄素和黄素蛋白。
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- 发表时间:
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- 通讯作者:
上田龍: "ショウジョウバエのRNAiプロトコル(誘導型RNAi)"細胞工学. 21・8. 931-940 (2002)
Ryu Ueda:“果蝇RNAi协议(引导RNAi)”细胞工程21・8。
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- 作者:
- 通讯作者:
Noboru Doi: "Short-interfering-RNA-mediated gene silencing in mammalian cells requires Dicer and eIF2C translation initiation factors"Current Biology. 13・1. 41-46 (2003)
Noboru Doi:“哺乳动物细胞中的短干扰RNA介导的基因沉默需要Dicer和eIF2C翻译起始因子”Current Biology 13・1(2003)。
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- 作者:
- 通讯作者:
程久美子: "哺乳類培養細胞でのsiRNAによるRNAiプロトコル"細胞工学. 21・9. 1058-1061 (2002)
Kumiko Hodo:“在培养的哺乳动物细胞中使用 siRNA 的 RNAi 方案”《细胞工程》21・9(2002 年)。
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