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RNAi関連蛋白質の分子機能と分子間相互作用の解析

RNAi相关蛋白的分子功能和分子间相互作用分析

基本信息

批准号：
15030207
负责人：
善野修平
金额：
$ 4.1万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15030207/
关键词：
Dicer RISC siRNA eIF2C RNAi 二本鎖RNA RnaseIII PAZ

项目摘要

平成16年度は、細胞抽出液を用いたRISCのin vitro解析を中心行った。HeLa細胞の抽出液を用い、siRNA含有蛋白質複合体の形成について、ゲルシフト分析した。時間経過に伴い、2つの増加する複合体(80Sとその他)と減少する複合体(40Sとその他)を検出し、最終的に最も大きな複合体1つに収斂する事を見出した。その最終複合体について、超遠心によるグリセロール密度勾配分画をしたところ、80Sリボソーム画分に一致し、RNAi関連蛋白質(Dicer, eIF2C, Gemin3,Gemin4,FMR1,p68)もその画分に存在することを抗体検出により確認した。この結果は、米国の研究グループから報告されているハエのRISCの結果と両立する。また、UVクロスリンクによりsiRNA末端に直接結合する蛋白質を検索したところ、200kDa前後に時間経過に伴い減少する交差結合体2つと、60kDa前後に時間経過に伴い増加する交差結合体2つ(新規RNAi成分と考えられる)を検出した。200kDa前後の複合体は免疫沈降試験からDicerと推定できた。同様に、siRNAを導入した細胞から抽出液を調製し、ゲルシフト及び超遠心によりsiRNA含有複合体を分析したところ、80S複合体と40S複合体の2つを検出した。これらはin vitroでsiRNA複合体形成した際に観察された分子量の大きい方からの2つの複合体に相当する。現在、この両複合体画分に対するRISC活性の確認作業を進めているが、まだRISC活性を見出すに至っていない。一方、ハエ胚抽出液を用いた同様な分析では、40Sリボソーム画分にRISC活性が存在することを予備的には確認している。

Heisei 16 years, cell extract with RISC in vitro analysis center line HeLa cell extracts were analyzed for the formation of siRNA-containing protein complexes Time passes, 2 increases, 2 decreases, 3 decreases, 4 decreases, 3 increases, 4 decreases, 3 decreases, 4 decreases, 4 The final complex, ultra-telecentric complex, density mapping, and RNAi-associated proteins (Dicer, eIF2C, Gemin3,Gemin4, FMR1,p68) were identified. The results of this study are reported in the United States and the United States. Protein detection for direct binding to siRNA termini, UV detection for direct binding to siRNA termini, time lapse with decrease around 200kDa, time lapse with increase around 60kDa, cross conjugate 2 (new RNAi component detection) were detected. The complex around 200kDa is immune to sedimentation. The same siRNAs were introduced into the cells and extracted from the cells. The siRNAs were analyzed for the 80S complex and the 40S complex. The molecular weight of the siRNA complex was measured at the time of formation of the siRNA complex. Now, the identification of RISC activity in this complex is progressing, and RISC activity is detected. The presence of RISC activity in the extract was confirmed by the same analysis.