リボザイムを利用した胚性幹細胞における未分化維持遺伝子のスクリーニング

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マウス胚性幹細胞(ES細胞)は、in vitroでの培養が可能な多能性幹細胞である。しかし、その多能性維持を可能にしている細胞内機構に関しては不明な点が多く、マウス以外の動物種におけるES細胞の培養も困難を極めている。そこで我々は、マウスES細胞における、多能性維持機構を解明するために、リボザイムあるいはRNAi活性を利用した網羅的な遺伝子のスクリーニング法を確立し、ES細胞の多能性維持に必須の分子の同定を試みることにした。ES細胞へのリボザイム、siRNAの導入にはレトロウイルスベクターを用いることにした。ES細胞は、非常にわずかな培養条件の変化により容易に分化が誘導されてしまうことから、ベクターの導入方法の十分な検討が必要であった。パッケージングの方法についていくつかのパッケージング細胞を用いて検討を行った結果、ES細胞を未分化状態に保ったまま10^6IU/mlの高効率でベクターを導入できる条件の設定に成功した。次に、コントロールの標的遺伝子として、GFPを発現するES細胞を作製し、GFPに対するリボザイムを設計して、GFPの発現に対する影響を調べたが、用いたいくつかのリボザイムではGFPの発現低下をおこすことができなかった。リボザイムの設計にはいくつかの制約があり、標的配列の設計の自由度が低いことから、RNAi活性を利用することに方針変更した。siRNAの発現にはH1RNAのプロモーターを利用することにし、siRNAを細胞内で発現させるためのユニットを構築した。これをレトロウイルスベクターに導入し、GFPを発現するES細胞のほか、ルシフェラーゼを発現するES細胞を作製し、それぞれの発現に対するsiRNA発現の影響を検討している。また、ES細胞内に導入したsiRNAの発現ユニット中のDNA配列をひとつのコロニーからPCRを用いて回収するための条件設定にも成功し、現在ランダムな配列をもつsiRNAライブラリーの構築を進めている。