DNA-高分子複合化デバイスを用いた遺伝子変異検出用マイクロチップの開発

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申請者らは昨年度までに、化学合成した長鎖サンプル(60量体)の正常型と一塩基変異型をアフィニティー・キャピラリー電気泳動法によって迅速かつ正確に分離識別することに成功した。さらに生体試料から抽出したゲノムDNAの標的部位をPCR法で増幅して得た二重鎖DNAをエキソヌクレアーゼ法で一本鎖にしたサンプルDNAについても、同様に分離検出できることを明らかにして本法の実用性を実証した。最終年度では、本手法を任意の塩基配列の標的遺伝子に適用する為の設計指針の確立を試み、本法の一般化を目指した。これまでは、リガンドDNAの配列および鎖長を設計するにあたっては、ある程度の経験則に基づいて試行錯誤の上で適するものを決定するしかなかった。そこで本年度ではこれまでに得られた分離達成条件を整理した上で、リガンドDNAとサンプルDNAで形成される二重鎖DNAの熱安定性と分離達成度に相関関係があるはずという作業仮説を立てた。次に、6種類のリガンドDNAを化学合成し、その濃度を一定値に固定した上で、正常型と一塩基変異型を確実に分離識別できる塩濃度条件を詳細に決定した。それと同時に、これらのリガンドDNAとサンプルDNAで形成される二重鎖DNAの融解温度を上記の塩濃度条件の範囲で決定した。分離が確実に達成される塩濃度条件での融解温度を調べた結果、正常型サンプルDNAとリガンドDNAの融解温度が15℃〜25℃であることと、一塩基変異型サンプルDNAのそれが0℃以下であること、という明確な条件が存在することが明らかになった。以上より、上記の条件を満足するようにリガンドDNAの配列および鎖長を設計すれば、試行錯誤をすることなく、任意の標的遺伝子の一塩基変異を検出できることが示された。